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点击此处下载我们的荧光指南或者阅读下面的第一章。
2023年8月24日更新。
荧光和荧光检测是许多研究应用的核心。许多固定和活细胞成像技术依赖于免疫荧光或荧光蛋白。荧光技术也可用于许多常见的实验室分析,包括流式细胞术、ELISA、western blot、免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)。
与其他分析技术相比,荧光检测方法具有一些优势,包括高灵敏度、定量分析,以及使用一系列可用激光器、滤光片和荧光团进行多重分析的潜力。
本指南将提高您对如何在研究中使用荧光的理解,并建议您为实验选择合适的荧光团和荧光蛋白。首先介绍荧光及其工作原理,然后讨论更先进的荧光机制,如荧光共振能量转移和时间分辨荧光最后,该指南涵盖了基于荧光的实验的基本试剂,包括荧光团、串联染料和荧光蛋白。
荧光是一种被称为荧光团的化学物质在特定波长吸收能量并使其兴奋时检测到的光信号。荧光团然后释放出波长更长的光,因为它放松并返回基态。
荧光是一个三阶段的过程,如图1所示。在第一步(1)中,用激光产生的电磁光照射荧光团,并通过光学滤光片来创建非常特定的波长,与分子的特征激发波长相匹配。光为分子中的电子从基态(Gs)跳到激发态(Es)提供了合适的能量。在第二步(2)中,电子吸收光并达到激发状态。
图1。荧光事件的三个阶段。
在最后一步(3)中,电子经历振动弛豫,达到激发电子态中的最低振动状态,然后弛豫到基态。当电子返回基态时,能量以光子的形式释放。
释放的能量和发射光子的波长是荧光团的特征,并决定其颜色和特征发射光谱。发射光的波长比激发光长,因为电子经历振动弛豫,在发出荧光之前以热的形式发出能量。激发光和发射光之间波长的差异称为斯托克斯换档.
串联荧光染料是共轭的“双”荧光分子,例如PE-Cy5。在抗体上,它们将足够接近,以便能量可以在两者之间转移。使用的激光激发波长只会激发给体分子(如PE),而不是激发受体分子的正确波长。然后从供体分子释放的能量将处于正确的波长,以激发受体分子中的电子。然后,受体分子将在其特征波长以光子的形式释放能量。
因此,例如,PE-Cy5将在PE的激发波长(565 nm)激发,并在Cy5的发射波长(670 nm)发射。
无论您是否需要选择一种或多种荧光色素,我们都会制作一个新的荧光色素图表,以使过程快速简便。它包含30种最常用荧光色素的对齐发射和激发光谱,以及图表中描述的常用仪器激光器和过滤器的信息,以便于可视化。我们提供了一个循序渐进的指南,指导您完成整个过程。
在此处下载荧光图表。