1.简介

高分子晶体学（MX）是获取生物大分子及其组装体结构信息的一种强有力的方法。自20世纪90年代以来，先进的第三代同步加速器被用于产生微米大小的高通量X射线束，其焦点大小与小晶体（库萨克等。, 1998; 里克尔等。, 2005; 埃文斯等。, 2011; 史密斯等。, 2012). 尺寸小于10µm的X射线束现在在许多同步电子辐射设施中被常规使用（Evans等。, 2011)并能够从体积小于1000µm的晶体中确定晶体结构^三（库萨克等。, 1998). 利用这些微束，塞浦路斯病毒多面体蛋白（Coulibaly）的结构等。, 2007)淀粉样纤维（Nelson等。, 2005)以及许多解决G蛋白偶联受体的结构和功能的复合物（GPCR；Cherezov等。, 2007; 拉斯穆森等。, 2007, 2011)由微米大小的晶体确定。

非弹性和吸收事件在晶体中沉积能量，触发各种化学反应，导致原子重新定位（在实验过程中），最终降低晶体顺序，并相应地增加“辐射损伤”水平。因此，即使在低温条件下，衍射数据的质量，尤其是高分辨率的衍射数据，也会随着施加到晶体上的X射线剂量的变化而迅速恶化。自从最早的大分子晶体学出现以来，这个问题就通过将从多个晶体中收集的部分数据集组合成一个高分辨率的完整数据集来解决。20世纪90年代，低温冷却成为高分子晶体学的常规（亨德森，1990; Garman&Schneider，1997年)，延长了单个晶体的寿命，但随着第三代同步加速器上波荡光束线的实施，即使是低温冷却晶体，也可以在短时间内沉积出容许的X射线剂量（Ravelli&Garman，2006). 在单晶上使用多个位置的数据收集方案（Riekel等。, 2005)，在整个晶体或来自多个晶体的部分数据集（布罗德森等。, 2003)已开发。多晶体方法的主要复杂性在于，在不同晶体上或在单晶上不同位置测量的数据之间的系统差异可能会阻止推导出一致的组合数据集。然而，亨德里克森和同事（刘等。, 2012)最近的研究表明，通过消除实验误差源，并仔细选择一致的部分数据集进行合并，实际上可以利用天然蛋白质中S原子的异常信号来组装具有足够精度的相位数据集。除其他技术外，通过“螺旋扫描”程序（Flot等。, 2010)，在数据收集过程中，通常是针状的单晶被连续移动，以暴露出同一晶体的新部分。

在处理小晶体时，通常不可能使用光学显微镜准确定位晶体，因为晶体尺寸较小，晶体周围的材料导致光学变形，或者晶体嵌入不透明基质中。所有这些问题都存在于从脂质立方相（LCP）生长的GPCR晶体的数据采集过程中。切列佐夫等。(2009)描述了一种方法，在该方法中，首先使用一束小光束对装有LCP的晶体进行系统光栅化，以测试每个位置的衍射。然后在第二步中使用旋转方法收集数据（Arndt&Wonacott，1977)从实际检测到衍射的位置。该方法的应用在结构测定GPCR，其中晶体较小（约为25×6×4µm^三)并且对光不可见，因为脂质中间相晶体在低温冷却后变得不透明。最近，提出了一种替代程序，即对整个样品架进行射线照相，以定位晶体（沃伦等。, 2013).

由自由电子激光器（FEL）产生的超短X射线脉冲，每一个脉冲持续几十飞秒甚至更短，最近已经证明可以克服上述剂量限制。被称为“破坏前的衍射”，原子的惯性阻止了短曝光脉冲期间原子的显著位移（Neutze等。, 2000; 布泰等。, 2012; 巴蒂等。, 2012)尽管最初的光吸收最终会导致等离子体的形成和样品的完全蒸发。典型的系列飞秒结晶（SFX）实验从室温下流经聚焦X射线束的蛋白质微晶液悬浮液中收集了数万或数十万个单晶X射线衍射“快照”（查普曼等。, 2011). 由于每个自由电子激光脉冲都会破坏样品，因此每个晶体只能收集一个衍射图案。新的数据处理工具，如猎豹,CrystFEL公司（白色等。, 2012, 2013; 基里安语等。, 2011)和cctbx.xfel公司（科恩等。, 2013)已开发用于处理这些大数据量，并已成功应用于几个示例（查普曼等。, 2011; 布泰等。, 2012; 雷德克等。, 2013; 科恩等。, 2013).

这个晶体结构属于布氏锥虫促甲状腺素B（TbCatB）及其天然前肽的复合物代表了通过在自由电子激光器（Redecke）上应用SFX方法获得的第一个新的生物信息等。, 2013). 这种酶具有科学和医学价值，因为其编码基因的敲除已被证明对导致非洲昏睡病的寄生虫是致命的（阿卜杜拉等。, 2008; 布莱恩特等。, 2009)从而使TbCatB成为迫切需要的潜在新药靶标（Fairlamb，2003). TbCatB晶体在杆状病毒感染的昆虫活细胞内自发生长，蛋白质过度表达至最长尺寸的10-15µm（Koopmann等。, 2012). 在最近的一次实验中（Redecke等。, 2013)，这些晶体被用于在LCLS上通过SFX获得178875个单晶衍射图案，这使得结构测定酶的分辨率达到2.1º。

受SFX方法和处理大型数据集的新功能以及成功的结构测定使用SFX方法对原形态中的TbCatB进行检测，我们开始了一项实验，以确定晶体结构属于布氏锥虫使用体内生长的微晶被安装在标准尼龙环中，用于微焦点同步加速器束线上的晶体数据采集。由于细胞残留物存在于体内晶体悬浮液、单个TbCatB晶体难以在冷冻冷却的样品中检测到。我们的程序将SFX中的元素与微晶照相中使用的螺旋线扫描方法相结合。与SFX方法一样，记录的探测器帧的初始未知子集包含衍射信号，这些衍射信号被选择用于进一步处理成晶体数据集。与FEL记录的快照不同，样品在曝光过程中旋转，可以从同一晶体获得多次曝光，然后以一致的方式进行处理。在下文中，我们描述了衍射实验、数据处理和结构确定。独立确定晶体结构pro-cappin B的T.brucei通过使用同步加速器和自由电子激光辐射源的两种不同方法提供了一个独特的机会来验证彼此取得的结果，我们对晶体模型进行了比较。

2.结果

2.1. 样品制备和数据收集

根据我们之前制定的方案，在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了TbCatB的自发结晶（图1; 科普曼等。, 2012). 这个体内由于晶体具有较高的机械和化学稳定性，所以通过细胞裂解和分步离心分离纯化晶体。晶体制备的纯度通过以下方法进行验证扫描电子显微镜（SEM）。在衍射数据收集之前，含有大约5×10的针状晶体的悬浮液⁸平均尺寸为0.9×0.9×11µm（约9µm）的每毫升晶体^三添加40%(v（v）/v（v）)甘油作为冷冻保护剂。在含有约5000个晶体的标准20µm厚尼龙环（美国汉普顿研究院，直径0.7 mm）中沉淀后，安装少量约13 nl的晶体悬浮液。

图1 Sf9细胞自发结晶锥虫组织蛋白酶B的光显微照片。将分离和纯化的晶体（插图）安装在标准冷冻环上，用于串行同步辐射衍射实验。

利用4×5µm（FWHM）微焦点光束在PETRA III储存环（DESY，汉堡）的P14微焦点光束线上进行衍射实验，总计光子通量1.2×10¹² 光子⁻¹在样品位置，光子能量为10.00 keV。尼龙环安装在连接到MD3微衍射仪（法国莫伊兰斯ARINAX）的MK3微型卡帕测角仪头上，并使用气态氮气流将其保持在110 K（英国牛津仪器公司Cryojet XL）。衍射数据记录在PILATUS 6M-F检测器（DECTRIS Ltd，Baden，Switzerland）上。

在一组初始实验中，对单个TbCatB晶体的衍射特性进行了表征。将所选晶体相对于X射线束光学定心后，在曝光时间为2s时以1°的振荡范围收集的单衍射图像显示衍射点扩展到高于3º的分辨率（支撑图S2）。使用一系列短旋转曝光，通过对衍射图像的目视检查，并将其作为一个标准（见支持信息），我们根据经验确定了在现有条件下0.5–1 s的晶体寿命。观察到的晶体寿命与计算的0.88 s的寿命很好地对应通过 放射性核素（Paithanar和Garman，2010年)估计最大剂量率为34 MGy s⁻¹.

为了收集完整的数据集，我们采用了一种数据收集策略，其中600×600µm的感兴趣区域通过旋转曝光进行光栅扫描（图2). 进行了120次平行螺旋扫描，间隔5µm。在每一次螺旋扫描中，测角器从Ω=−45°至Ω=+45°（其中Ω=0°对应于垂直于入射光束的环表面方向），并平移600µm。在每次螺旋扫描过程中进行240次持续1s的曝光，探测器上记录的每一帧对应于0.375°的旋转和2.5µm的平移。在这些条件下，感兴趣区域内的每个晶体都接受50至60MGy的剂量。选择这个高总剂量（多次曝光的积分）来收集每个晶体可能的最高分辨率数据。使用上述策略，在8小时内获得了28800个检测器帧。

图2 系列同步辐射晶体学实验装置。(一)使用内联显微镜成像的标准低温回路的串行螺旋线扫描方法的宏观示意图。(b条)隔离物的SEM图像体内在硅载体上生长组织蛋白酶B微晶。红色箭头表示串行螺旋线扫描。入射光束由红色“耀斑”表示。耀斑中的颜色密度与计算出的二维高斯函数成正比，半高宽为4×5µm，相对尺寸为10µm比例尺，显示出光子通量远离梁中心。红点表示线扫描期间收集帧的位置，每个帧的振荡宽度为0.5°。图表（下半部分）根据任意坐标显示了每个区域的输送剂量，表明由于光束的半高宽比和每个线扫描位置之间的间隙，每个区域的总剂量在50%到60%之间波动。(c（c）)连续螺旋线扫描后，样品暴露部分的光致电离宏观可见。(d日)预选后晶体环衍射图像的热图CrystFEL公司.色条编码每个衍射图案中布拉格峰的平均强度，作为每个图案中衍射强度的指示。

2.2. 数据处理和结构确定

采用最近建立的SFX实验衍射图案处理方法CrystFEL公司软件套件（白色等。, 2012)作为识别和索引大型探测器框架内单晶衍射图案的第一步。包含在同一螺旋扫描期间连续记录的衍射图案的帧被视为来自同一晶体，并被组装成595组，包含两到十个连续帧（图2d日和支撑图S2）。这些组被进一步视为常规轮换数据，用于重新索引和整合应用XDS公司（卡布施，2010年). 水平相邻的衍射图像组（可能包含来自同一晶体的衍射图案）被独立处理。在标准的三维轮廓填充程序中，将全部和部分记录的反射进行整合。130个组的处理成功，共包含557帧。

经过迭代合并和缩放，将分辨率范围为88至3.0º的109 661个反射强度合并为最终数据集，该数据集由8881个合并反射强度组成，总体完整性为99.8%。最后一组反射强度包括从120组80个TbCatB晶体中收集的426个衍射图案的数据。基团大小的分布（支持图S2）明显反映了TbCatB制剂中晶体大小的变化（参见Redecke的图S1等。, 2013). 大多数数据来自三到五个连续帧的组，对应于一个晶体的总旋转范围为1.125–1.875°。一小部分数据来自包含8到10帧的组，而大多数组包含3到5个连续帧。

数据的质量和内部一致性是根据标准来判断的我/σ(我)〉统计数据，并根据最近提倡的CC*标准，作为决定所获得数据的分辨率截止值的单一统计有效指南（McCoy等。, 2007; Karplus&Diederichs，2012年; 埃文斯，2012). TbCatB数据集分辨率外壳中计算的CC*（支持图S1）表明存在分辨率为3.0º及以下的统计显著数据。

遵循与之前确定的相同的策略布氏锥虫前胰蛋白酶B晶体结构 通过SFX（重新调整等。, 2013)，通过以下方法获得初始相分子置换具有相位器（麦考伊等。, 2007)使用非糖基化和体外结晶TbCatB（PDB入口3个月; 科普曼等。, 2012)它缺乏作为搜索模型的前肽和碳水化合物链。在逐步建模和精细化，62个前肽残基和5个碳水化合物残基被手动放置在不同的电子密度图中。

精制TbCatB结构(R（右）系数=22.3%，R（右）_自由的=26.4%）共享木瓜蛋白酶样折叠，这是组织蛋白酶B酶的特征，包括前肽残基27-72和79-85，两者之间没有定义的电子密度，以及由两个组成的碳水化合物链N个-乙酰氨基葡萄糖（NAG）单体N-连接到Asn58（在前肽中）和另一个由两个NAG单体和一个组成的碳水化合物链β-甘露糖（BMA）分子N连接到酶域的Asn216。总的来说，TbCatB模型很好地定义了3.0Å分辨率的电子密度图。对于主要位于横跨残基His195–Asn209的环区内的九个柔性氨基酸侧链或碳水化合物结构的十个原子，未观察到电子密度。特别是对于SFX结构测定，在人工建模和精炼（图3).

图3 根据衍射数据集计算的电子密度的质量体内使用串行同步辐射晶体学（3.0º分辨率；左）和SFX（以3.0º的分辨率进行细化；PDB条目4小时; 右）技术。(一,b条)TbCatB–前肽复合物的表面表征由分子置换使用成熟的TbCatB结构（Koopmann等。, 2012)作为搜索模型。这些溶液始终显示出额外的电子密度（2F类光突发事件−F类计算, 1σ，蓝色）的前肽（绿色）与V型底物结合间隙结合，以及与前肽连接的两种碳水化合物结构（黄色）N(c（c）,d日)和成熟酶(e（电子）,（f）). 考虑到最大分辨率的差异，前肽以及两者碳水化合物，在电子密度图中得到了很好的定义，证实了相位不受搜索模型的影响。

3.讨论和结论

特别是对于尺寸在低微米范围内的晶体，大分子晶体结构的测定本质上受到辐射损伤的限制。在大多数情况下，当X射线通量如果布拉格反射足以测量到给定晶体中晶体有序度定义的最高分辨率，那么在收集完整的衍射数据之前，晶体将严重受损。因此，在实践中，需要在单晶上测量数据的分辨率和完整性之间寻求折衷。近年来，结合来自多个晶体的数据，可以确定许多重要的结构（拉斯穆森等。, 2011; 小（Siu）等。, 2013; 锂等。, 2013)尽管在合并多个晶体的数据时，系统误差会带来困难。最近推出的SFX利用自由电子激光的X射线从大量晶体中以最大分辨率收集“衍射-预破坏”状态下的单衍射图像，实现了克服辐射损伤问题的极端方法。

在这里，我们展示了一种使用同步辐射从微米大小的晶体中收集接近衍射极限的完整衍射数据的策略。该方法基于样品亚体积的连续照明，样品由安装在标准尼龙环中的微晶低温玻璃化悬浮液组成。在曝光过程中，样品被旋转，产生“经典”旋转帧（Arndt&Wonacott，1977)用于向X射线束呈现晶体材料的子体积。选择曝光子体接收的X射线剂量，以充分利用所用曝光时间内的晶体寿命，这是在这些条件下实现最大分辨率的要求。在悬浮液中假设准随机取向的微晶的组合和在每次螺旋扫描期间环的连续旋转将向光束呈现各种不同的晶体取向，有效地覆盖旋转空间，从而最终提供完整的衍射数据。

本研究中使用的晶体体积较小（～10⁷体积为9µm的晶体中的单位电池^三)与Metcalf及其同事（Coulibaly）研究的塞浦路斯病毒多面体（CPV）相比等。, 2007; ∼10⁸125µm的单位电池^三). 此外，TbCatB晶体嵌入基质中，产生高散射背景，类似于LCP中安装的GPCR晶体的情况，其中晶体通常体积较大（～10⁹600µm的单位电池^三; 切列佐夫等。, 2007). 虽然在CPV和GPCR案例中都采用了收集单个预先定心晶体衍射数据的系统策略，这里建议的串行策略在测量衍射强度的信噪比方面提供了质量相当的数据，而无需在数据收集之前识别和定心微米大小的晶体（参见支持信息）。

串行同步电子辐射衍射数据使我们能够使用标准技术对TbCatB结构进行相位调整和细化。关于使用FEL辐射从TbCatB收集的数据集，在同步加速器收集的数据扩展到较低的分辨率，反映了用飞秒激光脉冲测量无辐射损伤的“无限小静止”数据与晶体宏观旋转超过0.375°之间的差异，在这两种情况下剂量相似。此外，不同级别的背景会影响数据质量。当直径约为4µm的液体喷射器为SFX提供样品时，在本研究中，使用20µm尼龙环悬挂20µm厚度的薄膜来安装晶体。根据同步加速器数据建立的结构模型与用自由电子激光辐射获得的模型一致，提供了相互验证。

串行同步加速器策略的当前实现可以在许多方面进行改进。将最大尺寸约为10µm的TbCatB晶体嵌入由缓冲液和细胞碎片组成的厚度约为20µm的玻璃化基质中，会导致显著的背景散射，可以通过使用不同的安装技术（如冷冻EM技术的适应性）将其降至最低（Nederlof等。, 2013)或石墨烯支架（Wierman等。, 2013). 将光束尺寸减小到1×1µm将使背景散射减少20倍。增加通量密度X射线束的减少将缩短数据收集时间，目前对于单环安装的晶体悬浮液滴来说，数据收集时间为几个小时。这可以通过使用改进的X射线光学和宽带单色器来实现。将在多个回路上收集的数据合并将增加信噪比，而减小每个X射线剂量单位的旋转增量可以提高衍射数据的分辨率，使其更接近晶体中有序度的限制。

本文提出的方法概念简单，可以在许多微焦点同步辐射光束线上使用现有的螺旋扫描方案来实现。它有助于收集悬浮小晶体的数据，例如从体内制剂，因为它避免了几乎看不见（或看不见）的晶体居中。可以调整参数以最大限度地提高精度(例如对每个暴露的子体积应用更大的旋转范围可以实现更精确的积分和缩放）或最大化分辨率（通过在应用容许X射线剂量期间使用较小的旋转范围）。

除了作为独立方法的应用前景外，为特定结晶蛋白质收集的串行同步加速器和SFX数据的组合还为SFX数据缩放和相位调整提供了一种新的策略。与SFX数据收集相比，串行同步加速器晶体学允许提取准确的衍射数据，尽管由于有限的旋转范围和曝光期间辐射损伤的开始，分辨率较低，通过系统采集少量微晶的结构因子振幅，然后应用定义明确的缩放模型模拟精细控制的实验过程。相比之下，目前，当使用部分记录强度的算术平均值而不进行缩放时（基里安等。, 2011). 利用同步辐射获得的完整准确的低分辨率数据集对SFX数据进行自举定标，可以改善这些程序的收敛性能。如果可以使用同步加速器和自由电子激光源的X射线在同一系统上收集衍射数据，那么这些数据的组合使用就有可能提供比这两种方法中的一种更准确的晶体数据，最终从微米级的晶体中获得高质量的大分子结构。