2.1. 氧化还原域蛋白质的TERTU_2913和TERTU_3803编码

碳水化合物活性酶数据库（CAZy）根据序列、结构和活性对碳水化合物活性酶中的结构域进行分类(网址：www.cazy.org)（利瓦瑟等。, 2013). 在注释船蛆共生体基因组的同时T.特纳一些基因似乎编码含有CBM的蛋白质[参见Boraston等。（2004年)和吉尔伯特等。(2013)鉴定了具有未知功能的领域。其中之一是TERTU_3803，它包含一个CBM10和一个CBM2结构域，连接到一系列不同的模块（通过柔性连接子），这些模块与通常在碳水化合物活性酶中发现的催化结构域没有任何序列相似性。这种未知函数的域在CAZy中用X定义n个分类（其中n个是一个数字），直到家庭成员具有功能特征，以便对该域的角色进行更完整的定义。因此，TERTU_3803中的四个结构域被指定为X122、X132、X173和X183结构域，另外两个结构域用其Pfam（蛋白质家族）分类进行了注释（图1). 使用“模块漫游”方法（Hemsworth等。, 2014)，我们搜索了编码这些X域的其他基因。这导致了TERTU_2913的识别，它缺乏CBM，但包含预测的X122、X183和X132域（图1). 这些蛋白质与奥康纳检测到的几种蛋白质有一些相似之处等。(2014)在他们对船蛆肠道的蛋白质组分析中，我们相信这些蛋白质应该在细菌的自然环境中产生。

图1 的域批注(一)TERTU_3803和(b条)我们分析中使用的TERTU_2913。这些数字表示线性氨基酸序列中的残基，其中预测会出现结构域边界。柔性链接器以灰色显示，预测域按域类型着色。每个蛋白质中X132结构域N末端的小粉红色结构域构成了Pfam中注释的DUF1687结构域。本研究中表达和使用的结构体标记在全长蛋白下方。域和链接器不是按比例绘制的。

进一步的序列分析表明，X122结构域与来自红褐肉座菌，一种蛋白质，在纤维素上生长期间在该生物体中上调，但其功能尚未阐明（福尔曼等。, 2003; 雅各布森等。, 2013). pf08450-X173结构域对似乎与标记为PQQ依赖性葡萄糖的蛋白质具有远距离序列相似性/L（左）-尚未进行生化表征的山梨醇脱氢酶和糖内酯内酯内切酶，而X183和X132结构域包含CxxCH基序，通常在c（c）-类型细胞色素和也可以在中找到日本血吸虫Cbp2D（分行等。, 2021; 加德纳等。, 2014). 信号肽类在这两种蛋白质的N末端鉴定，表明它们可能是分泌的，LPMO也是分泌的。综上所述，这些序列分析表明，TERTU_3803和TERTU_2913可能在纤维素代谢中发挥作用，此外，鉴于其线性氨基酸序列中存在细胞色素结构域，该作用可能是氧化还原作用。在尝试生产全长蛋白质失败后大肠杆菌，我们选择尽可能表达单个结构域，以便对这些蛋白质进行初步的结构和功能研究。我们成功地从TERTU_2913中纯化了三个X183结构域，我们称之为TtX183A、TtX183 B和TtX1183C；TERTU_3803和TERTU_2913中的每个X122域，此后分别称为TtX122A和TtX122 B；和来自TERTU_3803的pf08450-X173结构域对用于进一步表征（图1).

2.2。TtX183A和TtX183B的结构揭示c（c）-类细胞色素结构域

TtX183A、TtX183 B和TtX1183C均来自TERTU_2913，从大肠杆菌与pEC86质粒（Arslan）编码的细胞色素成熟机制共表达后的周质等。, 1998). 所有三种蛋白质都进行了晶体试验，但只有TtX183A和TtX183 B形成了衍射晶体。TtX183A的结构是通过单波长确定的反常色散从血红素铁产生的异常信号到1.4Å的分辨率(支持信息表S1). 随后使用所得模型确定TtX183B的结构分子置换分辨率为1.8º(表S1). TtX183A和TtX183 B中每一个的多肽链围绕血红素折叠，产生一个三级构造由…支配α-螺旋，如预期的小型c（c）-类型细胞色素[图2(一)]. 这两种蛋白质都显示出共价结合的血红素分子，该分子通过TtX183A中18和21位以及TtX183 B中20和23位的两个Cys残基附着到多肽上。这些代表了在保守的CxxCH五肽基序中存在的两个半胱氨酸c（c）-类型细胞色素。血红素-铁配位球在两种结构中完成，组氨酸（TtX183A中的His22和TtX183 B中的His24）和甲硫堇（TtX183A和Ttx183 B中分别为Met55和Met56）侧链位于血红素分子中心铁的轴向位置[图2(b条)]. 此外，TtX183A和TtX183 B均由二硫键稳定[图2(一)]. 过去有人认为二硫化物可能在细胞色素等电子转移蛋白中发挥作用c（c）_第6页（豪等。, 2006; 施拉布·里德利等。, 2006). 然而，随后的工作表明，它们更有可能用于结构稳定性（梅森等。, 2012)因此，考虑到此处研究的蛋白质的细胞外性质，我们认为二硫化物很可能在TtX183A和TtX183 B中存在，以保持稳定性。

图2 (一)TtX183A（左）和TtX183 B（右）域结构的卡通表示。血红素辅因子以棒状显示，按原子类型着色，碳以绿色或青色显示。与血红素部分共价连接的半胱氨酸也显示为与轴向甲硫堇和组氨酸结合的键，它们协调中心铁原子。形成二硫键的半胱氨酸的位置也显示为棒状，并用箭头突出显示。(b条)TtX183A（左侧，含绿色碳原子）和TtX183 B（右侧，含氰碳原子）的代表性电子密度图。第2个F类光突发事件−F类计算每个结构的地图以蓝色等高线显示在1处σ、和F类光突发事件−F类计算地图显示绿色为正密度，红色为负密度，等高线为4σ. (c（c）)TtX183A（黄色）和TtX183 B（橙色）与SoxA（PDB ID）的叠加4v2k版)其中催化域已被着色为灰色，并且电子转移域已被着色为蓝色。重叠显示了丙酸血红素如何被掩埋在更大的蛋白质中以促进电子转移往返于催化位置。

为了检查我们的TtX183畴结构中的结构相似性，我们比较了TtX183A和TtX1183B，发现这些结构彼此重叠，在59℃以上的r.m.s.d.为1.12ºα位置。我们还将结构与CjX183重叠日本血吸虫我们最近分析的Cbp2D（分行等。, 2021)，在62摄氏度上覆盖1.49Å的r.m.s.d.sα77℃以上，s和0.92ºα分别用于TtX183A和TtX183 B。这些叠加揭示了血红素部分是所有X183结构中暴露的相对溶剂；然而，CjX183中连接螺旋线2和螺旋线3的环在两个TtX183域中都明显较短(支持信息图S1). 在CjX183中，该环与血红素丙酸基团相互作用，这意味着这些基团在TtX183A和TtX183 B中暴露的溶剂要多得多，这可能对这些域中还原态的稳定性产生连锁效应（稍后讨论）。此外，在我们的叠加中，这个循环在TtX183A和TtX183 B之间变化最大[图S1(一)和S1(b条)]，这可能会对每个域的氧化还原特性产生重大影响。

使用大理服务器（霍尔姆，2020年)揭示了这些域与c（c）-硫代硫酸盐脱氢酶SoxA（PDB ID）中存在的细胞色素结构域4v2k版; 格拉巴兹克等。, 2015)与2.3和2.1μs的r.m.s.d.s分别重叠73和70个氨基酸。这与我们之前将CjX183与PDB（Branch）进行比较时得到的结果类似等。, 2021). SoxA和相关蛋白在硫酸盐代谢中起作用，X183结构紧密匹配的结构域存在，将电子穿梭到末端电子受体在单独的催化域[图2(c（c）)]（格拉巴兹克等。, 2015). 因此，血红素丙酸基团埋藏在靠近SoxA中催化血红素的地方，以实现高效电子转移而等效基团是暴露在我们结构中的溶剂[图2(c（c）)]. 由于此处研究的X183结构域是更大蛋白质的一部分，因此这些结构域也可能存在于TERTU_2913中，以调节电子向或来自蛋白质的转移催化域蛋白质内，或酶伙伴蛋白质内。

为了深入了解全长TERTU_2913的整体架构，我们使用AlphaFold公司2（跳线等。, 2021)预测其结构。生成了五个模型，其中各个域的结构在所有模型中彼此一致，并通过程序进行了高置信度的预测[图S2(一)]. 有趣的是，蛋白质中的长柔性连接体本应提供AlphaFold公司2具有在空间中自由放置域的相对自由度，但在所有模型中，X183域都彼此靠近放置[图S2(b条)]. 我们通过实验确定的X183A和X183B结构也可以叠加到这些具有低r.m.s.d.值的模型上，使我们能够可视化血红素部分在这些域中的可能定位[图S2(c（c）)]. 这个AlphaFold公司2个模型还首次揭示了蛋白质C末端X132结构域的可能结构，据我们所知，该结构域没有结构或功能特征的同源物。X132域包含一个额外的CxxCH基序，预计该基序将与血红素结合，并且在AlphaFold公司2个模型此图案通常也放置在X183域附近[图S2(c（c）)]. 虽然蛋白质显然将具有显著的灵活性，并且这些结构域可能是可移动的，但该分析表明天然蛋白质中血红素部分的潜在共定位，并支持X183结构域可能在电子转移到或从一个已确定的电子受体或捐赠者。因此，我们开始测试我们的初始假设，即TERTU_2913和TERTU_3803可能在LPMO生物化学中起作用，方法是测试我们作为LPMO电子供体纯化的还原X183结构域。

2.3. TtX183不会向TtAA10提供电子来攻击纤维素

我们测试了所有三个分离的TtX183结构域作为TtAA10的电子供体特纳菌（分公司等。, 2021; 福勒等。, 2019). 我们首先通过添加过量的抗坏血酸来制备还原X183，随后使用PD-10脱盐柱去除抗坏血酸钠。通过与磷酸溶胀纤维素（PASC）孵育，在纤维素LPMO活性测量中立即使用这些样品代替小分子还原剂。矩阵辅助激光器解吸电离飞行时间质谱法然后用于检测LPMO作用释放的氧化产物。使用抗坏血酸作为电子源的阳性对照组重现了之前的结果，即LPMO从底物中释放出氧化的低聚糖产物(图S3)（福勒等。, 2019). 然而，当还原的X183被用作电子源时，我们无法检测到任何被释放的氧化产物。该结果与我们之前使用CjX183的观察结果形成对比，因此我们进一步探讨了这些域的氧化还原特性，以寻求对LPMO明显缺乏电子捐赠的解释。

2.4. TtX183畴显示出与服务电子转移功能相一致的氧化还原特性，但迅速失去电子

我们首先使用紫外-可见光谱分析了TtX183A、TtX183 B和TtX189 C的光谱特性。正如预期的那样c（c）-型细胞色素，这些结构域的可见光谱均由来自Soret带在409nm处，铁状态下，吸光度增加α和β还原到铁状态后，分别在550和520 nm处出现谱带[图3(一)和3(c（c）)]. 为了获得亚铁状态的光谱，有必要在样品中保持过量的抗坏血酸，或在厌氧室中制备样品，然后在进行UV–Vis测量之前将其密封。在有氧环境中制备的样品在测量完全还原状态的光谱之前会迅速氧化。这表明这些X183畴中的亚铁状态不是很稳定；因此，在我们试图测量LPMO活性的过程中，电子很可能被O丢失，而不是给酶提供电子₂.

图3 典型的紫外-可见光谱(一)铁（氧化）和(b条)TtX183域的亚铁（还原）形式。TtX183A、TtX183 B和TtX18.3 C的光谱分别以蓝色、红色和绿色显示。这个α-和β-在亚铁状态下，谱带在523nm和552nm处显示最大值，氧化后谱带变平为宽峰。这个Soret带在氧化时也从419纳米转移到409纳米。所有三个光谱重叠非常紧密，表明每个X183结构域具有相似的血红素环境和电子特性。(c（c）)热解石墨边缘上TtX183A、TtX183 B和TtX182 C蛋白膜在pH 7.0下的特征CV工作电极颜色如中所示(一)和(b条). 热解石墨边缘的空白测量工作电极在没有蛋白质的情况下，薄膜显示为灰色。CV中观察到的氧化还原对的中点电位用于确定血红素铁在每个域中的还原电位。

为了进一步阐明所观察到的电子损失是否是血红素氧化还原特性的结果，我们使用循环伏安法测量了每个域的还原电位。蛋白质分别分配在碳电极并允许在厌氧环境中形成薄膜。然后将电极浸入缓冲液中，并记录循环伏安图（CV）。因此，与标准氢电极（SHE），分别[图3(c（c）)].c（c）-类型细胞色素与SHE相比，中点还原电位范围为−390 mV至+450 mV；然而，如本文所观察到的X183结构域的His/Met结扎患者，通常预期在该范围的高端具有中点还原电位（Liu等。, 2014). 因此，我们测量的这些区域的还原电位略低于预期，但也都低于LPMO的典型报告值（Aachmann等。, 2012; 鲍里索娃等。, 2015; 福斯伯格等。, 2014; 赫姆斯沃思等。, 2013; Zouraris公司等。, 2018). 因此，人们期望这些结构域能够向这些酶提供电子。如前所述，在TtX183A和TtX183 B的结构中，血红素丙酸基团高度暴露在溶剂中，在CjX183中发现一个环与这些基团相互作用(图S1). 当O₂存在，解释了与CjX183相比，TtX183的还原状态明显缺乏稳定性（支路等。, 2021).

我们观察到的TtX183结构域的快速氧化出乎意料，这解释了TtAA10缺乏电子捐赠的原因。如果没有用于生化表征的全长TERTU_2913蛋白，很难说这些结果是否具有功能相关性。大多数细胞外多域c（c）-含有细胞色素的类型蛋白质小心地定位其多个血红素分子，以允许电子转移跨越长距离并且通常包含催化域（爱德华兹等。, 2020). 为了进一步了解TERTU_2913和TERTU_3803的潜在功能，我们着手进一步表征这些蛋白质中的一些非血红素结构域。

2.5. Ttpf08450-X173不结合PQQ，也不具有葡萄糖脱氢酶活性

爆炸使用Ttpf08450-X173序列进行的搜索返回了与注释为PQQ依赖的蛋白质最接近的序列匹配D类-葡萄糖/L（左）-山梨糖酮去氢酶。PQQ依赖酶，在CAZy中被注释为AA12s，已被证明是有效的LPMO激活剂，可能在生物量分解（Várnai等。, 2018). 因此，我们从pET26b构建物中生产了Ttpf08450-X173，用于结构-功能研究，该构建物将蛋白质定向到大肠杆菌周质并允许通过C末端组氨酸标签轻松纯化蛋白质。蛋白质可以很容易地浓缩到10–20 mg ml⁻¹但经过几轮晶体试验，我们无法获得这种双畴结构的晶体，从而进行结构分析。因此，我们进行了分析，试图在缺乏结构信息的情况下确定这些域的潜在作用。PQQ相关D类-葡萄糖/L（左）-山梨醇脱氢酶应被氧化D类-葡萄糖到D类-葡萄糖酸-1,5-δ-使用PQQ辅因子的内酯，其被还原为喹啉形式。我们最初试图用D类-葡萄糖酸/D类-葡萄糖酸-δ-Megazyme的内酯检测试剂盒，但在与葡萄糖孵育后，我们无法检测到任何活性。质谱法和紫外-可见光谱随后表明，PQQ未与蛋白质共同纯化。在添加PQQ的情况下进行分析，仍然未能产生任何以下迹象酶活性因此，我们尝试使用等温滴定法检测PQQ与蛋白质的结合热量测定法（ITC）。实验在有钙和无钙的情况下进行²⁺对于许多PQQ依赖酶（Oubrie）中的PQQ结合至关重要等。, 1999; 斯汀斯·乔梅尔等。, 2020)，但在我们测试的任何条件下，我们都无法检测到PQQ绑定。这表明这些结构域不能与PQQ结合，因此可能无法提供PQQ依赖的脱氢酶活性。这些结构域可能与另一种氧化还原辅因子结合，但我们无法在文献中找到除PQQ与此类蛋白质结合以外的辅因子的例子。在缺乏结构信息的情况下醌类这可能存在于自然界中，我们没有进一步探讨这些域可能利用的其他氧化还原辅因子。

2.6。TtX122A和TtX122 B具有β-一些糖苷水解酶、多糖裂解酶和凝集素的胶状卷曲褶皱

除了我们在Ttpf08450-X173上的工作外，我们还生产了TtX122A和TtX122 B，分别代表来自TERTU_3803和TERTU_2913的X122域。这些蛋白是作为单个蛋白在细胞周质中产生的大肠杆菌通过C-末端组氨酸标记纯化和进行结构和生化研究。两个畴都很容易结晶，这使得TtX122A的结构可以通过多重波长首先确定为1.8º反常色散使用在蛋白质表达过程中加入硒代蛋氨酸（Se-Met）的蛋白质(表S2). 随后，可以将天然蛋白质的结构确定为1.5º的分辨率。电子密度很容易解释，允许在不对称单元我们构建的蛋白质编码的残基3到244的链没有断裂。有了TtX122A的结构，可以通过分子置换使用TtX122A的单个原聚体作为初始搜索模型(表S2). TtX122B的三个分子存在于非对称单元，链B的电子密度最容易追踪，允许对残基2至235进行建模，链中没有断裂。链A和C的一些区域显示出更多的无序，因此在模型中，链A中的残基190和192与链C中的残基162和165之间存在断裂。除了蛋白质和水分子，基于配位几何结构和键长，将两个镁离子建模为TtX122A中每个原聚体上的电子密度[图S4(一)]; 这些离子可能与结晶介质结合。单个钙离子也可以在TtX122A和TtX122 B的每个原聚体中建模[图S4(b条)]; 每一个都位于一个主要由主链羰基介导的配位位点上，该羰基与稳定其他蛋白质的结构有关（雅各布森等。, 2013). 蛋白质没有接触钙²⁺由于纯化，所以这些离子必须与细胞中的蛋白质共同纯化。

为了检查我们的TtX122结构的低聚状态，国际学生成绩评估进行了分析，结果表明，晶体中两种结构的原聚体之间没有明显的分子界面，这表明分子在溶液中可能是单体（Krissinel&Henrick，2007). 因此，我们随后的结构分析侧重于每个结构中的单个原单体。TtX122A和TtX122 B的整体结构表明，这些域采用β-果冻卷折叠[图4(一)和4(b条)]. 这两种结构非常相似，可以相互叠加，在228℃以上的r.m.s.d.为0.42ºα位置[图S3(一)]. 由于结构如此相似，我们的其余分析将集中于TtX122A，它代表这两个域中最高的分辨率，因此也是最好的分辨率结构。使用大理服务器揭示了TtX122A和Cip1之间的紧密结构匹配H.杰科琳娜[PDB ID（PDB ID）3zyp公司，r.m.s.d.=2.7℃以上αs（雅各布森等。, 2013)]，一种PL20葡糖苷聚糖裂解酶，来自里氏木霉调用TrGL[PDB ID2兹日179℃以上，r.m.s.d.=3.0℃αs（科诺等。, 2009)]和小鼠半乳脑苷酶[PDB ID的凝集素结构域3锆5166℃时，r.m.s.d.=2.7ºαs（迪恩等。, 2011)] [图S3(b条)–S3(d日)]. 这些匹配分别与TtX122A仅具有21%、12%和11%的序列同一性，这表明本文研究的X122结构域相对于先前表征的含有类似结构域的蛋白质实例具有显著不同的序列。此外，这些结构匹配显示了角色的多样性β-果冻卷褶皱在整个进化过程中都得到了应用（维堡等。, 2019). Cip1表示与TtX122A最接近的结构和序列匹配，在H.杰科琳娜在纤维素上生长期间；然而，这种蛋白质的生化功能尚未确定（雅各布森等。, 2013). PL20本身就是催化结构域，通过β-消除（Konno等。, 2009)而来自半乳脑苷酶的凝集素结构域在构建该酶的活性部位中很重要，并介导与皂苷A的相互作用，皂苷A将底物传递给该酶（迪恩等。, 2011; 希尔等。, 2018),

图4 整体褶皱(一)TtX122A和(b条)TtX122B以相同的视角显示。在这两种情况下，钙结合位点用黄色球体表示，配位残基显示为棒状。(c（c）)TtX122A的分子表面以两个旋转180°的视角显示，并通过以下原因导致的序列守恒着色ConSurf公司使用648个序列进行分析。在左边，最保守的表面位于Arg118周围，并且位于具有该折叠的其他蛋白质中的活性或配体结合位点附近。在右边，最保守的区域围绕着钙离子，以黄色显示。(d日)以Arg118为中心的保守氨基酸的特写视图，它可能代表X122家族中的保守活性或配体结合位点。该区域最保守的残基显示为棒状，并按原子类型着色，碳原子根据ConSurf公司得分如所示(c（c）).

由于在我们的结构比较中确定的蛋白质之间的功能相似性有限，我们对648个X122家族成员进行了序列比对，并使用ConSurf公司服务器（Ashkenazy等。, 2016). 这表明蛋白质表面有两个显著保守的斑块[图4(c（c）)]，其中一个位于与稳定折叠有关的钙结合位点周围，而另一个在折叠的内表面形成保守表面β-以Arg118为中心的胶状卷曲褶皱[图4(d日)]. 对这个保守斑块的仔细检查表明，最保守的残基是Arg118、His100、Phe215、His213和Met131，以及稍微保守的Trp29、Asn129和Asp134残基[图4(d日)]. 这些残留物位于β-jelly-roll折叠，在许多具有该折叠的结构域中，它通常是活性位点或配体结合位点的所在地。雅各布森的分析等。Cip1的（2013）强调了一组类似的残基，如果该结构域是多糖裂解酶，则可能是活性位点。事实上，Cip1中的Arg100（相当于TtX122A中的Arg 118）被认为是潜在的催化残基，因为精氨酸可以作为碱与裂解酶酸性底物中的羧酸盐形成盐桥（Jacobson等。, 2013; Konno公司等。, 2009). 然而，没有证明Cip1具有任何显著的裂解酶活性（Jacobson等。, 2013).

为了进一步分析，我们提供了从ConSurf公司分析到ASSAM公司（纳齐林等。, 2012).ASSAM公司是一种工具，可用于搜索其他蛋白质中氨基酸的类似排列，而与蛋白质的总折叠无关。因此，这有助于从可能与感兴趣的蛋白质进化无关的其他蛋白质中识别功能位点。这个ASSAM公司搜索返回1073个PDB右手重叠，其中三到五个残基与TtX122A提供的残基子集匹配，r.m.s.d.s范围为0.85到1.80º。虽然这些位点中的许多似乎不是活性位点或结合位点，但通过检查在匹配残基附近包含杂原子（不是金属离子或可能的溶质分子）的结构，发现一些结构在附近包含碳水化合物部分。这些点击包括注释为β-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶、磷酸甘油酸变位酶，α-1,4-葡聚糖裂解酶、岩藻糖结合凝集素和果糖结合蛋白(图S6). 对具有TtX122A全结构的叠合物中碳水化合物位置的仔细检查表明碳水化合物由于与蛋白质的其他区域发生冲突，因此不太可能与此屏幕中确定的那些区域发生冲突。这使得鉴定用于酶/结合测定的潜在底物具有挑战性，但为这些结构域可能以某种能力参与与碳水化合物底物的结合或在碳水化合物底物上具有活性的观点提供了一些支持。

2.7. TtX122结构域没有显示明确的酶活性或碳水化合物结合功能

由于我们对TtX122A和TtX122 B的结构分析为这些结构域在这些蛋白质中的功能提供了很少线索，因此我们开始研究它们是否可能含有一些催化活性在多糖在自然界中发现。鉴于TERTU_3803氨基酸序列中存在CBM10和CBM2模块，我们使用薄层色谱法（TLC）探测一系列潜在活性多糖包括纤维素和甲壳素。该初步分析没有发现受试底物上的任何活性，并且吞吐量太低，无法进行大范围筛选。因此，我们尝试使用基因芯片在更广泛的底物上筛选潜在活性表位Vidal-Melgosa描述的耗尽方法等。(2015). 简而言之，此方法依赖于酶活性破坏识别的表位单克隆抗体特定于选择的（mAbs）多糖在微阵列中发现。因此，抗体结合的消除可用于揭示酶活性以及碳水化合物活性酶的底物偏好。根据一系列可溶性多糖使用此方法从陆地和海洋来源获取(表S3和图S7). 使用特定于多糖然后使用二级碱性磷酸酶结合抗体显色，其强度反映了一级抗体结合的水平。对得到的阵列进行扫描，并测量每个样品的平均光斑强度。然后，将X122处理样品的强度测量值与非酶控制阵列进行比较，从而生成热图，揭示在每种情况下观察到的抗体结合倍数变化。对于TtX122A和TtX122B都观察到非常相似的结果(图S7)，其中在某些藻酸盐（主要是PAA和PAU，见表S3)以及小麦阿拉伯木聚糖，其中可以观察到抗体结合的两倍或三倍变化。与阳性对照组相比，这些结果似乎微不足道，因为当使用聚半乳糖醛酸水解酶和果胶酸裂解酶作为阳性对照时，可以观察到高达19倍的抗体结合损失。

我们分离的X122结构域没有明确的活性，考虑到这些结构域与凝集素样结构域的结构相似性，我们考虑这些结构域是否可以代表新的碳水化合物结合结构域。因此，我们为TtX122A和TtX122 B生产并纯化了新的构建物，其中绿色荧光蛋白（GFP）通过N端或C端的短连接子与蛋白质融合。我们还包括一个结构体，其中来自TERTU_3803的CBM10 N末端到TtX122A被包含在该结构体中，与特征良好的CBM2b1-2:GFP结合域一起用作阳性对照（Hervé等。, 2010). 烟草茎横截面与这些GFP融合蛋白孵育，然后用荧光显微镜检查，以确定这些结构域是否对植物细胞壁具有显著的亲和力多糖存在于这些组织中。阳性对照在显微镜下发出清晰的荧光信号，如先前所观察到的（Hervé等。, 2010) (图S8). 我们无法单独从X122A:GFP或X122B:GFP融合蛋白的组织中检测到任何荧光，仅观察到CBM10-X122A:GFP蛋白的微弱信号(图S8). 因此，我们得出结论，这些结构域并不介导与植物细胞壁的结合多糖在很大程度上。

4.1. TtX183A、TtX18.3B和TtX183 C的表达与纯化

TERTU_2913（GenBank:ACR10928.1）的编码序列在T.特纳T7901基因组序列（NCBI核苷酸CP001614），通过密码子优化合成，用于在大肠杆菌作者：Genewiz。随后将编码TtX183A（核苷酸184至438）、TtX183 B（核苷酸649至891）和TtX1183C（核苷酸1840至2082）的区域克隆到pCW-LIC中^安培pelB下游的载体（Cheryl Arrowsmith的礼物，Addgene质粒26098）先导序列使用聚合酶不完全引物延伸（PIPE）克隆（Klock&Lesley，2009). 随后在BL21（DE3）细胞（Invitrogen）中通过pEC86的血红素成熟基因的共表达产生蛋白质^凸轮矢量（Arslan等。, 1998). 然后，在2xYT培养基（16 gl）中培养1 l个细胞⁻¹胰蛋白胨，10 gl⁻¹酵母提取物，6 gl⁻¹NaCl），37°C，在挡板烧瓶中，以180 r min的速度摇晃⁻¹直到A₆₀₀达到0.6。然后将温度降至16°C，并通过添加IPTG诱导基因表达，最终浓度为1 mM（M）培养物在隔夜生长，然后在5000下离心收集细胞克持续20分钟。

将细菌颗粒重新悬浮在3倍体积的20 m中M（M）Tris pH值8.0，150 mM（M）40µl 10 mg ml之前的NaCl和20%蔗糖⁻¹每克细胞糊中添加溶菌酶。细胞在冰中孵育1小时，在60µl 1M（M）硫酸镁₄也添加到样本中。在冰上再放置20分钟后，将悬浮液离心至12000克去除含有周质组分1的上清液，并将颗粒重新悬浮在3倍体积的冰镇Milli-Q水中。将其在冰上培养1小时，然后在12000下再次离心克持续20分钟。去除上清液并与周质组分1结合，形成最终的周质裂解组分。随后通过将蛋白质应用于在缓冲液a（20ml）中平衡的5ml HisTrap FF柱（Cytiva），从这里纯化蛋白质M（M）Tris–HCl pH值8.0，150 mM（M）氯化钠和30 mM（M）咪唑）。然后使用线性梯度将蛋白质洗脱至最终浓度300 mM（M）咪唑超过20个CV，收集1.8 ml馏分。通过SDS–PAGE对组分进行分析，将含有所需蛋白质的组分合并，使用3kDa截止Vivaspin浓缩器（Sartorius）浓缩至小于1ml的体积，并应用于16/600 Superdex 75色谱柱（Cytiva），该色谱柱在20m内平衡M（M）Tris pH值8.0，150 mM（M）氯化钠。再次，通过SDS–PAGE分析分馏样品，并使用3kDa分子量截止浓缩器合并和浓缩选定部分。通过测量A测定样品浓度₄₁₀对于haem辅因子和106000的消光系数M（M）⁻¹厘米⁻¹.

4.2. 结晶、X射线数据采集和结构测定用于TtX183A和TtX183 B

TtX183A的晶体是使用吊滴蒸汽扩散法获得的，储层含有20–25%(w个/五)桩号6000，1M（M）氯化锂₂和0.1M（M）柠檬酸盐pH 4.0，而形成TtX183B的条件包含15–25%(w个/五)PEG 6000，200米M（M）pH 5.0和200 m的醋酸钠M（M）氯化钠。在这两种情况下，将TtX183A与5 mg ml混合，形成1:1µl滴⁻¹和TtX183B，浓度为10 mg ml⁻¹使用母液，在20°C下培养屏幕1周，以使晶体生长。

为了收集数据，在液氮中进行闪蒸冷却之前，将单晶转移到含有贮存溶液和15%甘油的低温保护剂溶液中。在欧洲同步辐射设施的MASIF-1自动数据收集束线上测量了TtX183A的X射线衍射数据，同时在钻石光源的束线I24上收集了TtX183B的数据。两种情况下的衍射数据均使用XDS公司（Kabsch，2010年)和中央对手方清算所4我2（波特顿等。, 2018). 使用单波长确定TtX183A的结构反常色散使用haem铁在SHELXC/D/E公司管道（Sheldrick，2008, 2015). TtX183B的结构由分子置换使用去除血红素和水分子的TtX183A模型作为搜索模型。所有模型建筑和精炼在中执行库特（埃姆斯利等。, 2010)和REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 1997)，并使用验证了最终模型摩尔概率（威廉姆斯等。, 2018).

4.3. 基质辅助激光检测LPMO活性解吸电离质谱法（MALDI-MS）和TtX183s作为电子源

使用PASC建立TtAA10活性测定[根据Wood（1988）编制)]或Avicel作为主要基板。首先，在50 m内制备1 ml样品M（M）醋酸钠pH 6.0缓冲液，含1 mg/ml⁻¹Avicel或PASC和1µM（M）TtAA10.然后，1米M（M）抗坏血酸被用作电子施主阳性对照。当TtX183A、TtX183 B或TtX18.3 C被用作电子源时，血红素首先通过添加1 m的化学还原剂进行化学还原M（M）抗坏血酸，在将蛋白质添加到100µM（M）。在室温下，在试管旋转器（Stuart Scientific）上对反应进行端对端培养过夜。在进行质谱分析之前，样品在10000下离心克使任何固体材料颗粒化1分钟。

对于MALDI-MS测量，将1µl样品与10 mg ml当量体积混合⁻¹在Bruker SCOUT-MTP 384靶板上，在50%乙腈和0.1%三氟乙酸中加入2,5-二羟基苯甲酸。然后将斑点样品在灯下在空气中干燥，然后通过质谱法在Ultraflex III MALDI-TOF/TOF仪器（Bruker）上，如Hemsworth所述等。(2014).

4.4。TtX183A、TtX1183B和TtX183 C的UV–Vis分析

在Cary60分光光度计（安捷伦）上的1 cm石英试管中测量了TtX183A、TtX183 B和TtX180 C的紫外-可见吸收光谱。制备氧化X183结构域，1 mM（M）将铁氰化钾添加到100µM（M）蛋白质，然后通过PD-10脱盐柱去除多余的氧化剂，然后再进行测量。制备还原X183蛋白质，1 mM（M）将抗坏血酸添加到100µM（M）蛋白质，然后通过PD-10脱盐柱去除多余的还原剂。最初，还原实验是在工作台上进行的（需氧），但在观察血红素的快速氧化后，X183蛋白被还原，并在厌氧室中通过PD-10柱。使用Suba Seals（Sigma–Aldrich）密封由此制备的样品，以转移至紫外-可见分光光度计进行测量。

4.5. 使用TtX183A、TtX1183B和TtX183 C的薄膜伏安法

使用标准的三电极装置，对TtX183A、TtX183 B和TtX182 C进行四级变换的大振幅交流伏安法测量，该装置由一个工作的热解石墨边缘电极组成，该电极连接到一个在静止模式下运行的Orgiatrod旋转器上，该电极是一个标准的甘汞电极参比电极和铂丝对电极。这三个电极被放置在一个定制的电化学电池内（由约克大学化学系玻璃车间建造），电池周围有一个恒温控制的水套，水套保持在5°C。每次测量使用10µl浓度为100µ的蛋白质M（M）用吸液管吸到一个新磨损的工作电极表面（使用1200级金刚砂纸）并保持吸附1分钟。测量在pH 7.0的缓冲液中进行，缓冲液由150 m组成M（M）氯化钠和50 mM（M）醋酸盐、Tris、磷酸盐和MES。通过添加200 mV，将测量电位转换为与SHE相比的值。

4.6. Ttpf08450-X173的表达与纯化

TERTU_3803（GenBank:AACR14707.1）的编码序列在T.特纳T7901基因组序列（NCBI核苷酸CP001614），通过密码子优化合成，用于在大肠杆菌作者：Genewiz。随后使用PIPE克隆方法将编码Ttpf08450-X173的区域（核苷酸1243至3204）克隆到pelB信号肽下游的pET26b载体中（Klock&Lesley，2009). 该蛋白是在37°C下生长的1 l 2xYT培养物中的BL21（DE3）细胞中产生的，摇晃180 r min⁻¹直到A₆₀₀达到0.6。然后将培养物冷却至20°C并在120 r min下摇晃⁻¹在用IPTG诱导之前，将其添加到最终浓度1 mM（M）培养物生长过夜，并通过在3985下离心收获克在4°C下保持20分钟。

如上所述，对TtX183A、TtX183 B和TtX18.3 C进行周质裂解。蛋白质首先通过加载到5 ml HisTrap FF（Cytiva）柱上进行纯化，该柱已与缓冲液a（50 m）平衡M（M）HEPES pH值7200 mM（M）氯化钠和30 mM（M）咪唑）。用缓冲液A的5个CV清洗色谱柱后，通过线性梯度洗脱蛋白质，得到100%缓冲液B（缓冲液A+300 mM（M）咪唑）跨20个CV收集1.8 ml馏分。使用30 kDa分子量截止的Vivaspin浓缩器（Sartorius）将含有Ttpf08450-X173的峰馏分合并并浓缩至约5 ml的体积。然后使用缓冲液C（50 m）将样品稀释十倍M（M）Tris pH值8，50 mM（M）NaCl），并应用于5 ml Q FF（Cytiva）柱进行离子交换纯化，之前在同一缓冲液中进行了平衡。使用样品后，用5个50 m的CV清洗色谱柱M（M）Tris pH值8，50 mM（M）线性梯度至100%缓冲液D（缓冲液C+0.5）前的NaClM（M）NaCl）应用于20个CV。然后，在梯度上收集1.8 ml组分。使用30 kDa分子量截止浓缩器（Sartorius）再次合并并浓缩含有Ttpf08450-X173的峰馏分，直到样品体积小于1 ml。然后将样品应用于16/600 Superdex 200（Cytiva）凝胶过滤柱，该柱在SEC缓冲液（20 m）中平衡M（M）Tris pH值8200 mM（M）氯化钠）。然后，在空隙体积通过之后收集1.8ml级分。使用30kDa分子量截止浓缩器再次合并并浓缩含有Ttpf08450-X173的峰组分。样品也用20 m的缓冲液交换M（M）Tris pH值为8，以提供最终样品，该样品由A定量₂₈₀使用111870的消光系数进行测量M（M）⁻¹厘米⁻¹.

4.7.D类-葡萄糖酸/D类-葡萄糖酸-δ-Ttpf08450-X173的内酯测定

使用D类-葡萄糖酸/D类-葡萄糖酸-δ-内酯检测试剂盒（Megazyme），一种校准曲线通过连续稀释a 1制备M（M）1µ葡萄糖酸储备液M（M）至200µM（M）最终体积为2.54ml，使用蒸馏水。然后，将0.1 ml每种稀释液转移到一个试管中，该试管含有2.00 ml蒸馏水（约25°C）、0.2 ml分析缓冲液（pH 7.6）、0.2 ml NADP+和ATP溶液以及0.02 ml 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH）。在用Parafily密封试管后，通过温和倒置混合此样品。还制作了一个空白，包含2.10毫升蒸馏水、0.2毫升缓冲液、0.2毫升NADP+/ATP溶液和0.02毫升6-PGDH。在Cary60分光光度计（安捷伦）中，在约25°C的1 cm光路中，在340 nm处约5分钟后读取溶液的吸光度。通过添加0.02 ml葡萄糖酸激酶悬浮液（GCK）开始每个试管（包括空白试管）中的反应。6分钟后再次测量吸光度。绘制这些吸光度以生成校准曲线。

为了测试pf08450_X173蛋白是否具有葡萄糖去氢酶活性，建立了含有20μM（M）HEPES pH 7.0，5 mM（M）葡萄糖，1米M（M）PQQ，2米M（M）氯化钙₂，1米M（M）抗坏血酸和±5µM（M）Ttpf08450_X173，总体积为0.1 ml。将每个反应与分析成分混合，以代替生成校准曲线。在约5分钟后，在Cary60分光光度计（安捷伦）中再次测量每个样品在340 nm处的吸光度。

4.8. 等温滴定法热量测定法使用PQQ和Ttpf08450-X173

使用MicroCal ITC200仪器（Cytiva）进行ITC实验。蛋白质和PQQ样品在20 m内制备M（M）HEPES pH 7.0，250 mM（M）氯化钠。用于钙存在下的实验²⁺，5米M（M）氯化钙₂包含在蛋白质和配体样品中。该蛋白质存在于20µ的细胞中M（M）且PQQ存在于200µM（M）在注射器中。在20°C下进行滴定，参考功率为5µcal s⁻¹注射之间的延迟时间为120 s。在数据分析之前，拒绝第一次注射（0.5µl）。

4.9. TtX122A和TtX122 B蛋白的表达与纯化

使用前面描述的TERTU_3803和TERTU_2913的合成基因，通过PIPE克隆方法在pET26b的pelB先导肽下游克隆了TtX122A（TERTU_3803中的370到1089个核苷酸）和TtX122 B（TERTU_2913中的1042到1752个核苷酸）的编码序列（Klock&Lesley，2009）). 蛋白质由BL21中的两种构建体产生（DE3）大肠杆菌在2xYT培养基的1 l培养基中。培养物在37°C下生长，在200 r min下摇晃⁻¹直到A₆₀₀达到0.6，此时温度降至16°C，30分钟后，将IPTG添加至最终浓度1 mM（M）.培养物培养过夜，然后在5000℃下离心收集细胞克持续20分钟。

按照上述对TtX183A、TtX183 B和TtX1 83C的描述进行周质裂解。随后使用与用于TtX183A、TtX183 B和TtX18.3 C的类似方案纯化蛋白质。简单地说，将蛋白质应用于5 ml HisTrap FF（Cytiva）亲和柱，该亲和柱在缓冲液a（50 m）中平衡M（M）HEPES pH值7200 mM（M）氯化钠，30米M（M）咪唑）。用缓冲区A的5个CV清洗柱后，从0到100%的缓冲区B（缓冲区A+300 mM（M）咪唑）用于20个CV，收集1.8 ml组分。将峰级分合并并在10kDa分子量截止的Vivaspin浓缩器（Sartorius）上浓缩至小于1ml的体积。然后将样品应用于16/600 Superdex 75（Cytiva）凝胶过滤柱，该柱已在SEC缓冲液2（20ml）中平衡M（M）HEPES pH值7200 mM（M）氯化钠）。然后，在40 ml的空隙体积后收集1.8 ml组分。然后将含有TtX122A或TtX122 B的峰组分合并并浓缩在相同的10 kDa分子量截止浓缩器上，并用缓冲液交换至20 mM（M）HEPES pH值7。样本从A中量化₂₈₀使用54 555的消光系数的吸光度M（M）⁻¹厘米⁻¹和56 045M（M）⁻¹厘米⁻¹分别用于TtX122A和TtX122 B。

Se-Met标记的TtX122A是通过在硫堇营养缺陷型中表达该蛋白而制备的大肠杆菌菌株B834（DE3）。在补充了BME维生素（Sigma–Aldrich）和L（左）-（+）-Se-Met（Anatrace），使用与上述天然蛋白相同的表达方案和后续纯化程序。使用电离子化质谱分析确认Se-Met并入蛋白质，并使用与天然蛋白质相同的消光系数对蛋白质进行量化。

4.10. 结晶、X射线数据采集和结构测定用于TtX122A和TtX122 B

TtX122A缓冲区交换为10 mM（M）纯化后，蛋白质浓缩器上的HEPES pH值为7，最终浓缩至18.6 mg ml⁻¹用于结晶试验。在0.1中获得初始晶体命中M（M）乙酸镁，20%PEG 3350，随后通过改变沉淀剂浓度在悬挂液滴中进行优化，以生成用于数据收集和结构确定。将TtX122A的天然晶体转移到防冻溶液中，该溶液由添加20%乙二醇的母液组成。浸泡30秒后，将样品快速冷冻，然后放入液氮中进行数据采集。在钻石光源的光束线i04上收集天然蛋白质的X射线衍射数据，然后使用XDS公司（Kabsch，2010年)和中央对手方清算所4我2个软件套件（Potterton等。, 2018).

通过以下方式解决TtX122A结构的初步尝试分子置换使用Cip1结构（PDB ID3zyp公司; 雅各布森等。, 2013)由于搜索模板不成功，因此如上所述制备标记为TtX122A的Se-Met。Se-Met标记的蛋白质在与用于天然蛋白质的条件相同的条件下结晶，晶体在低温冷却前用母液和20%乙二醇进行低温保护，以收集数据。在钻石光源光束线i03上收集了0.9798、0.9800和0.9645 Au波长的衍射数据，代表用于结构确定，分别是。数据使用索引XDS公司（Kabsch，2010年)然后在中央对手方清算所4我2个软件套件（Potterton等。, 2018). 然后使用SHELXC/D/E公司管道（Sheldrick，2008, 2015)生成初始模型，该模型随后使用连续几轮重建和精炼在里面库特（埃姆斯利等。, 2010)和REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 1997)分别是。Se-Met标记蛋白的晶体与天然TtX122A的晶体同构，因此去除了柔性区域和水分子的模型在库特（埃姆斯利等。, 2010)和REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 1997)分别给出最终的本机TtX122A结构。

TtX122B缓冲区交换为10 mM（M）蛋白质浓缩器上的HEPES pH值为7，与TtX122A相同。将等体积的蛋白质以10 mg ml的浓度混合，在静滴液中获得晶体⁻¹使用0.2M（M）氯化钠、25%聚乙二醇3350和0.1M（M）双螺纹pH 6.5。直接从液滴中提取晶体，不添加任何防冻剂，直接注入液氮进行低温冷却。然后在金刚石光源的光束线i24上以0.970º的波长收集衍射数据。数据使用索引XDS公司（Kabsch，2010年)然后在中进行处理中央对手方清算所4我2（波特顿等。, 2018). 结构由以下因素决定分子置换在里面相位器（麦考伊等。, 2007)使用TtX122A原聚体结构作为搜索模型。最终的结构经过了后续几轮人工建造精炼使用库特（埃姆斯利等。, 2010)和REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 1997)分别为。

4.11. 薄膜液相色谱法以及用于TtX122A和TtX122B活性测量的多糖微阵列分析

使用TLC进行检测TtX122A的酶活性的初步尝试。首先，2µM（M）将蛋白质与2 mg/ml一起孵育⁻¹底物（Avicel、柑橘果胶、褐藻酸、聚半乳糖醛酸、半乳甘露聚糖、地衣聚糖、鼠李糖乳糖醛酸，D类-（+）-纤维二糖，大麦β-葡聚糖、甘露聚糖、木葡聚糖、小麦阿拉伯木聚糖），20 mM（M）HEPES pH 7.0，总体积为1 ml，在室温下放置过夜，在旋转管上翻转末端（Stuart Scientific）。随后在16000℃下对样品进行离心分离克2分钟，以清除任何固体材料。然后，从每个样品中取出100µl上清液进行分析。样品被发现在TLC纸上，与葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖溶液相邻，作为标准溶液。将TLC纸的底端浸入乙酸和丁醇的溶剂中，使乙酸和丁醇向上迁移，直到达到向上的四分之三。随后使用热风枪将TLC纸干燥，然后浸入山茱萸醇溶液中进行染色。

对于多糖微阵列分析，定义多糖(表S3)在去离子水中溶解至4mg ml⁻¹随后用打印缓冲液（55.2%甘油、44%水、0.8%Triton X-100）将其稀释40倍。然后，将10µl这些底物溶液添加到384微孔板（PP微孔板，V形，Greiner Bio-One）的单独微孔中，在微孔板中加入2µM（M）添加浓度。为每种不含酶的底物溶液制备对照品，保持所有其他条件相同。反应使用尖曲霉内切聚半乳糖醛酸酶M2（巨酶）和曲霉属以聚半乳糖醛酸和果胶为底物的果胶裂解酶（Megazyme）作为阳性对照。填充板在100 r min下培养⁻¹在室温下培养2小时，然后通过将样品在80°C下培养10分钟来停止任何反应。不溶性材料通过在5000℃下离心造粒克在22°C和55%湿度下，使用Sprint Arrayjet微阵列机器人（英国罗斯林）将可溶性材料打印到孔径为0.45µm（Whatman）的硝化纤维素膜上10分钟。印刷阵列在PBS（140 m）中阻塞1 hM（M）氯化钠，2.7米M（M）KCl，10米M（M）纳₂高性能操作₄，1.7米M（M）千赫₂人事军官₄pH 7.5），5%(w个/五)低脂奶粉（MPBS）。然后，用MPBS稀释1:1000的探针培养阵列2小时，其中包括多糖特异性单克隆抗体和CBM（英国利兹的PlantProbes；法国南特的国家农业研究所；澳大利亚班杜拉的BioSupplies；葡萄牙里斯本的NZYTech）。阵列在PBS中彻底清洗，并用反对的-老鼠，反对的-鼠标或反对的-与碱性磷酸酶（Sigma）结合的His标签二级抗体稀释1:5000(反对的-老鼠和反对的-鼠标）或1:1500(反对的-他的标签）。在PBS和去离子水中清洗后，在碱性磷酸酶缓冲液（100 m）中含有5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和硝基蓝四氮唑的溶液中开发微阵列M（M）氯化钠，5米M（M）氯化镁，100米M（M）二乙醇胺（pH 9.5）10–15分钟，直到出现斑点。开发出的阵列以每英寸2400点的速度进行扫描（CanoScan 8800F，丹麦瑟堡），并转换为TIFF，然后使用Array-Pro分析仪6.3软件（媒体控制论，马里兰州罗克维尔）。为了进行分析，任何小于5的强度测量值均为5，表示几乎没有抗体结合。计算处理样品和未处理样品之间抗体结合的倍数变化多糖，使用TtX122A/B处理的阵列中的每个点都被非蛋白的强度测量值划分。

4.12条。在植物横截面上使用TtX122:GFP融合蛋白的荧光显微镜

通过使用PIPE克隆方法将sfGFP编码序列克隆到我们现有的TtX122A和TtX122 B pET26b结构中，生成生成融合GFP的TtX122A和tX122B的结构（Klock&Lesley，2009）). pET28a-sfGFP【Ryan Mehl的礼物，Addgene质粒85492（Peeler&Mehl，2012)]被用作聚合酶链反应模板生成GFP插入。我们设计了这样的结构，即GFP将被引入pelB信号肽和TtX122A/B之间或TtX122 A/B和C末端His标签之间，以分别产生N末端和C末端GFP融合。还生成了其他结构，其中包括TERTU_3803中连接到TtX122A的CBM10 N端，用作对照。随后，在BL21（DE3）细胞中产生蛋白质，如前面所述的TtX122A和TtX122 B pET26b构建物，并以相同的方式纯化。最终蛋白质由A定量₂₈₀使用消光系数73 590进行测量M（M）⁻¹厘米⁻¹, 98 820 M（M）⁻¹厘米⁻¹和75 080M（M）⁻¹厘米⁻¹对于TtX122A:GFP，CBM10-TtX122A分别为GFP和TtX122 B:GFP。

按照Hervé的描述，制备了烟草茎横截面并进行了荧光显微镜检查等。(2010).