1.简介
埃博拉病毒能够引起一种表现为严重出血热的疾病,病死率高达90%(1976年扎伊尔埃博拉出血热, 1978). 虽然疫情一般在地理上是孤立的,但2014-2015年的疫情造成了28000多例病例,并在各国之间传播(赫西等。, 2015). 埃博拉病毒是一种非片段化的负义RNA病毒,其RNA基因组在病毒的整个生命周期中都被病毒核蛋白(NP)包裹。这种蛋白-RNA复合物作为额外病毒蛋白的支架,包括病毒聚合酶,以进行病毒转录和复制。RNA、核蛋白和这些额外的病毒蛋白的复合物形成核衣壳,是埃博拉病毒的结构组成部分。全长埃博拉病毒核蛋白长度为739个氨基酸。然而,N末端450氨基酸(NP 1–450)对于蛋白质来说是必要的和足够的齐聚和RNA结合(渡边等。, 2006)蛋白质的N末端区域形成螺旋状细丝,类似于病毒粒子中的NP(Bharat等。, 2012).
NP的行列式齐聚和RNA结合一直是一些结构研究的重点。晶体结构与氢/氘交换质谱法已经表明NP的N末端区域具有一个折叠的核,其两侧是无序区域(Kirchdoerfer等。, 2015; 梁等。, 2015). NP的折叠核具有N端和C端叶,主要是α-螺旋结构。埃博拉病毒NP的有效晶体结构均使用单体NP(Dong等。, 2015; 柯奇多尔等。, 2015; 梁等。, 2015). 在其中两个结构中,NP与病毒蛋白35(VP35;Kirchdoerfer)的肽结合等。, 2015; 梁等。, 2015). 这种VP35肽的结合被认为对于维持NP的单体状态和防止宿主RNA的过早和非特异性包被是重要的(Kirchdoerfer等。, 2015; 梁等。, 2015; 莱拉等。, 2011).
去除VP35肽后,NP齐聚成线性聚合物能够封装RNA。齐聚作用NP的N端和C端蛋白区域介导到两个折叠的NP 1–450核心(Kirchdoerfer等。, 2015; 梁等。, 2015). 这个齐聚NP引起两个叶之间的构象变化,为RNA创造高亲和力结合位点(Kirchdoerfer等人。, 2015; 杉田等。, 2018). 埃博拉病毒核衣壳和埃博拉流感病毒NP 1–450的冷冻电子断层扫描(Cryo-ET)研究证明了NP丝的左手螺旋性质,以及NP的第一个结构证据齐聚调节NP单体之间接触的区域(Wan等。, 2017). 然而,这项早期冷冻电镜工作的分辨率有限,无法清楚阐明NP之间和与RNA的分子相互作用。最近一项使用单粒子冷冻电镜(cryo-EM)对NP 1–450进行的研究以3.6Å的分辨率确定了这种螺旋丝的结构(Sugita等。, 2018). 这种结构揭示了单体、伴侣NP和寡聚体、RNA-结合NP之间的分子相互作用和构象变化。在这里,我们使用单粒子低温电子显微镜以3.1º的改进分辨率测定了NP 1–450螺旋的结构。
2.材料和方法
2.1. NP螺旋丝的表达
NP细丝的制备方法与之前描述的方法类似(Bharat等。, 2012). 将不含任何额外肽标签的0.5 mg NP 1–450-pDisplay质粒稀释成20 ml Opti-MEM,然后通过0.22µm过滤器过滤。将1.5 mg聚乙烯亚胺(PEI)添加到5 ml Opti-MEM中。将DNA–PEI复合物在室温下孵育20分钟,然后以1.1×10的温度添加到1 l 293F细胞中6 细胞ml−1生长于293Freestyle培养基中,置于2l挡板烧瓶中。转染细胞在37°C和8%CO下培养2最低转速为130转−148小时。
2.2. NP螺旋丝的提纯
细胞在1000℃离心收集克15分钟,然后在8 ml 25 m中重新悬浮M(M)三氯化氢,150 mM(M)氯化钠,1 mM(M)氯化钙,5 mM(M) β-巯基乙醇。然后通过添加10 ml 25 mM(M)Tris–HCl pH 7.4,150 mM(M)氯化钠,1 mM(M)氯化钙,0.2%Igepal CA-630,5 mM(M) β-巯基乙醇。在3200℃离心澄清裂解液克持续20分钟。
通过将清除的裂解物装载到5ml 20%蔗糖和5ml 90%蔗糖的双层缓冲垫上来分离NP螺旋丝。蔗糖垫在超离心机中使用贝克曼SW28转子以28000转/分的转速旋转−1持续3小时。通过底部穿刺对蔗糖垫进行分级,并通过SDS–PAGE分析人工收集的~1 ml级分。将含有NP 1–450的组分透析至500 ml 25 mM(M)三氯化氢,150 mM(M)氯化钠,1 mM(M)氯化钙,5 mM(M) β-使用1 MDa分子量的巯基乙醇切断透析管过夜,更换一个缓冲液以去除蔗糖。然后将3 ml透析蛋白加载到两个不连续的氯化铯梯度中的一个梯度上,其中含有24 ml 25%(w个/v(v))氯化铯和10毫升60%(w个/v(v))氯化铯。氯化铯梯度在SW28转子中以28000转/分的转速旋转−14小时后,在底管穿刺后手动分馏梯度,并在隔夜透析含有NP 1–450的组分以去除氯化铯之前,用SDS–PAGE分析组分。
使用Beckman TLA100.3转子,在48000转/分的转速下,通过400µl 20%蔗糖缓冲液中造粒透析蛋白(~3 ml),浓缩NP 1–450−1将颗粒重新悬浮在400µl 25 m中1 hM(M)Tris–HCl pH 7.4,150 mM(M)氯化钠,1 mM(M)氯化钙,5 mM(M) β-巯基乙醇。测量再悬浮样品的紫外吸收率得出A类280第3.8页,带有A类260/A类280比率为1.8。
4.讨论
与其他非片段负义RNA病毒的核蛋白类似,埃博拉病毒核蛋白开始其生命,由VP35以单体形式伴随,然后转变为与病毒RNA结合的寡聚形式。这里,我们展示了寡聚RNA结合埃博拉毒核蛋白的高分辨率低温电子显微镜结构。从伴侣单体到寡聚体、RNA-结合形式的转变涉及广泛蛋白质-蛋白质界面的破坏和形成,这些界面与构象变化相耦合。从伴侣单体中去除VP35肽是这些变化的先决条件(Kirchdoerfer等。, 2015),尽管VP35是如何删除的体内尚不清楚,可能涉及其他细胞或病毒因子,如病毒聚合酶L。从NP中去除VP35后,NP N末端齐聚进入的单体的区域和横向NP面能够与相邻的NP相互作用。C末端的随后折叠齐聚螺旋创造了一个疏水平台,通过其C端叶结合传入的NP。NP的C端螺旋的这种相互作用我−1带有NP的C端叶我导致NP的C端叶移动我朝向N末端叶,形成RNA-结合位点。以这种方式向生长的低聚物中添加单体NP将允许病毒RNA在5′到3′方向包被,这是一种有助于病毒RNA共同复制包被的机制。与该模型相关的一个未知因素是,该过程是如何逆转以暴露病毒RNA以进行RNA合成的,正如核苷酸碱基当用NP包埋时,不能作为聚合酶模板。
此处介绍的3.1º分辨率结构概括了先前发布的3.6º分辨率(Sugita)结构中观察到的特征等。, 2018)包括蛋白质与蛋白质和蛋白质与RNA的相互作用。改进的分辨率提供了蛋白质侧链和核苷酸碱基,阐明NP原生质体和RNA之间的分子接触。埃博拉病毒仍然是世界卫生安全的新威胁。应对这一威胁的关键是发现和评估新的治疗方法。与RNA结合的埃博拉病毒NP的高分辨率结构将更好地描述以病毒核衣壳组装为靶点的潜在抗病毒药物。
致谢
我们非常感谢Mark Herzik和Bill Anderson在显微镜校准和数据收集方面的帮助。特别感谢Sebastian Raemisch在使用Rosetta放松。我们也感谢查尔斯·鲍曼的计算支持。
资金筹措信息
这项工作由NIH/NIAID向RNK拨款AI123498,向EOS和ABW拨款AI118016。
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