1.简介

线粒体含有大量蛋白质。然而，线粒体只能自行合成少数蛋白质（西克曼等。, 2003; 灰色等。, 1999). 大多数线粒体蛋白质在细胞溶质中被翻译，并通过一种多蛋白复合体运输到线粒体：外膜复合体的转位酶（TOM）和内膜复合体（TIM）的转位酶（Neupert&Herrmann，2007）). 一半以上的线粒体前蛋白是由N末端前序列合成的，这些前序列形成带正电荷两性恋的将前蛋白靶向线粒体的螺旋。前蛋白通过外膜（TOM）复合体的一般转定位酶和内膜（TIM23）复合体（Abe）的前序列转定位酶导入等。, 2000; 查辛斯卡等。, 2009; 吴莎，2006; 阿尔德等。, 2008; 沃尔格特尔等。, 2009). 经过TOM复合体后，带有N末端靶向预序列的前蛋白被Tim50（TIM23复合体的重要成员）在膜间空间（IMS；盖斯勒等。, 2002; 山本等。, 2002; 莫克拉尼亚克等。, 2003; 拉赫曼等。2014年). 在TIM23复合物中，TIM23蛋白的C末端半部分形成了穿过线粒体内膜的跨膜通道。Tim50的IMS域与Tim23的N末端IMS域相互作用，将前蛋白传递给Tim23（Schulz等。, 2011). Tim50还作为一种中枢蛋白与其他TIM23复合物成员（如Tim21）相互作用，以调节TIM23跨膜通道（Chacinska等。, 2005; 梅内克等。, 2006; 利托夫琴科等。, 2013).

Tim50的IMS结构域包含一个抗胰蛋白酶核心结构域，其中包含164–361个残基。这个晶体结构Tim50（164–361）的分辨率为1.83Ω（Qian等。, 2011). 这个晶体结构Tim50（164–361）含有一个大凹槽作为前序列的假定结合位点β-发夹。已经证明β-发夹对于Tim50和Tim23的相互作用至关重要，这表明这两种重要的Tim23蛋白在前蛋白输入中具有协同作用。据报道，N末端靶向预序列构成了一个两性恋的螺旋线（Abe等。, 2000). Tim50（164–361）结构中确定的假定预序列绑定槽足够大，可以容纳α-由预序列形成的螺旋线。然而，目前尚不清楚前蛋白受体Tim50如何在分子水平上与前序列螺旋相互作用。

Tim50作为膜间空间的前蛋白受体，能够与大量不同的前序列相互作用。为了适应不同的预序列，Tim50可能在假定的预序列绑定槽处表现出构象灵活性。这项研究提供了结构证据，表明Tim50的假定前序列结合槽在与不同前序列相互作用时表现出显著的可塑性。有趣的是，新解决的Tim50（164–361）结构中的晶体堆积提供了信息，以揭示Tim50的IMS域具体识别预序列螺旋并与之交互作用的机制。

2.方法

酿酒酵母Tim50（164–361）按照钱的描述进行表达和纯化等。(2011). 晶体是在100 m的条件下使用吊滴蒸汽扩散法生长的M（M）MES pH 6.0，1.6M（M）硫酸镁₄（表1). 晶体呈针状，尺寸为0.1×0.1×0.5mm。数据来自在含有20%甘油的母液中冷却的晶体。晶体在APS的SER-CAT光束线上将X射线衍射到2.67°分辨率（表2). 这些新获得的晶体没有以前产生的晶体衍射（钱等。, 2011)，可能是因为在非对称单元在新获得的晶体中。数据处理中使用了100幅振荡为1°的衍射数据图像。衍射数据使用香港（HKL）-3000（次要等。, 2006). Tim50（164–361）结构的原子坐标（PDB条目3夸尔; 钱等。, 2011)被用作分子置换方法中的搜索模型，使用相位器（麦考伊等。, 2007). 模型由手动构建库特（埃姆斯利和考坦，2004年).精炼使用REFMAC公司（Vagin&Teplyakov，2010年)来自中央处理器4套房（优胜者等。, 2011). 坐标和结构因子已存放在PDB中，并带有登录代码4平方英尺.

3.结果和讨论

在本研究中，我们描述了晶体结构酵母Tim50（164–361），这与我们之前报道的情况有显著不同（钱等。, 2011). 结构数据支持这样一种观点，即Tim50假定的前序列结合沟可能具有显著的结构灵活性，可以识别线粒体生物发生的各种前蛋白并与之相互作用。数据还说明了Tim50可以专门识别并与两性恋的预序列螺旋。

这个晶体结构属于酿酒酵母本研究中测定的Tim50（164–361）命名为Tim50_new晶体结构前面描述的Tim50（164–361）被称为Tim50_old（Qian等。, 2011). 使用Tim50_old作为搜索模型，通过分子置换法将Tim50_new的结构确定为2.67º分辨率（表1和2). 在Tim50_new结构中，残基177–356的电子密度可见。在Tim50_new中，Tim50 IMS结构域分子形成一个单体，由五个α-螺旋（A1–A5）和九个β-绞线（B1–B9）（图1). 该结构的核心由平行线构成β-由B1、B4、B5、B8和B9形成的板材。A类β-从Tim50分子表面突出约15Å的发夹由B2和B3以及B2和B3之间的短环形成（图1). 靠近突出部分β-发夹，Tim50_new包含一个大槽，该槽被假设为预序列绑定位置（图1). 一个中有六个单体非对称单元Tim50_new，而在非对称单元Tim50_old的。

图1 Tim50_new的晶体结构。(一)Tim50_new结构在功能区表示中显示为立体视图。分子的N端和C端被标记。二级结构A1、A2、B2和B3已标记。假定的预顺序绑定槽用箭头表示。图中所示的Tim50分子是单体E类在中非对称单元Tim50_new，属于I组(b条). Tim50_new结构如所示表面电位代表。Tim50_new分子的取向与(一). 适用于表面电位如下图所示。本文中的数字都是使用PyMOL公司.

当将Tim50_new结构与Tim50_old结构进行比较时，大多数分子重叠得很好。然而，突出部分发生了显著的构象变化β-由B2和B3以及附近的螺旋A2形成的发夹（图2一). Tim50_new的主体，不包括突出部分β-发夹和螺旋A2可以与Tim50_old中的对应物很好地重叠，主链原子的根-平方偏差（r.m.s.d）为0.550º。相反，突出物的尖端β-与Tim50_old结构相比，Tim50_new结构中的发夹偏离分子主体4.5°（图2一). 同时，附近的螺旋A2向突出的方向移动约5Åβ-发夹（图2一). 此外，Tim50_new中的螺旋A2比Tim50_old中的多2圈。因为突出β-发夹和螺旋A2构成Tim50假定的预序列结合槽的一侧，Tim50_new中的构象变化可能会显著改变槽的物理性质。这些结构观察表明，Tim50的IMS结构域在假定的前序列结合沟中表现出显著的结构可塑性，这可能在Tim50作为与各种前序列相互作用的TIM23复合体中的受体蛋白的功能中发挥重要作用。Tim50假定的预序列绑定槽有能力调整其自身构造，以适应不同尺寸、疏水性和其他物理性质的预序列，这是合理的。

图2 突出的部分β-发夹和附近的螺旋A2在Tim50分子中表现出结构可塑性。(一)金中的Tim50_新结构与银中的Tim 50_旧结构重叠。图中的Tim50分子从图1中的方向绕水平轴旋转约90°。图中假定的预序列绑定槽面向读取器。标记了次级结构A2、B2和B3。Tim50的N端和C端被标记。此处显示的Tim50_new结构是单体E类在中非对称单元，属于I组(b条)基团I和II的Tim50_新单体的结构重叠。I组单体E类为金和II类单体A类为青色。二级结构A2、B2和B3已标记。Tim50的N端和C端被标记。图中的Tim50分子与(一). 假定的预序列绑定槽已标记。

通过比较一个单体结构中的六种单体结构，可以进一步说明Tim50假定的预序结合槽的结构塑性非对称单元Tim50_new的。一个单体中的六个单体非对称单元Tim50_new的称为分子A类——F类当仔细检查这六个分子的结构时，我们发现这六个分子可以分为两组。分子B,C和E类在整个结构中都有非常相似的结构，属于I组。另一方面，分子A类,D类和F类在突出部分采用不同的构造β-发夹和螺旋A2来自第一组，属于第二组。当第一组构件的结构与第二组构件重叠时，很明显，两组构件之间的结构主体非常相似。然而，突出的β-发夹和螺旋A2显示了两组成员之间的显著差异（图2b条). 凸起主链原子的平方根偏差（r.m.s.d）β-当I组和II组单体重叠时，发夹和螺旋A2为～2º，表明假定的序列前结合槽内的构象发生了显著变化。突出的部分β-来自Tim50_ new和Tim50_ old的I和II组成员中的发夹和螺旋A2显示出三种不同的构象。因此，我们通过比较Tim50_new和Tim50_old结构以及比较非对称单元Tim50_new的研究表明，Tim50的IMS域在假定的预序列结合槽周围表现出显著的结构塑性。突出的部分β-Tim50 IMS域内的发夹和螺旋A2可以采用多种构象，而Tim50主体（164–361）保持一种稳定构象。

有趣的是β-发夹和螺旋A2在相同的结晶条件下，即使在结构上也表现出不同的构象。为了进一步了解Tim50_new的I族和II族成员采用不同构象的机制，我们检查了由晶体堆积产生的I族成员和II类成员的相邻分子。我们推断Tim50（164–361）的邻近环境可能在Tim50的构象中起着重要作用。令人惊讶的是，对于基团I和基团II的成员，假定的预序列结合槽被相邻单体的二级结构占据。对于I组成员，相邻单体的螺旋A1对接到假定的预序列结合槽中，而对于II组成员，邻近单体的N末端富含脯氨酸的环插入假定的预顺序结合槽中（图3). 与此形成鲜明对比的是，当我们检查Tim50_old结构中的晶体封装时，假定的预序列绑定槽实际上是空的（数据未显示）。因此，Tim50_old很可能代表Tim50 IMS域的无序列前构象，而Tim50_new对应于Tim50的IMS域序列前结合构象。第一组和第二组成员之间的结构差异非对称单元Tim50的新结构表明，Tim50 IMS域的假定预序列绑定槽可能采用不同的构象来适应各种预序列。

图3 Tim50_new分子的预设序列结合槽被晶体堆积产生的相邻分子的二级结构占据。(一)相邻分子（单体）的螺旋A1A类)对接在假定的单体预序结合槽中E类Tim50_新结构的主要原因是疏水相互作用。单体E类Tim50_new属于I组，以金色显示。相邻分子的螺旋A1以浅蓝色显示，并标记为A1′。单体的二级结构A2、B2和B3E类已标记。标记A1′的残基Tyr223、Tyr277和Gln230，B2和B3的残基Trp207和Trp213，A2的残基Asn240和Tyr244，这些残基参与相互作用。虚线表示A1的Gln230和A2的Asn240之间的氢键。(b条)相邻分子的N末端富含脯氨酸的环被插入到假定的单体预序列结合槽中A类Tim50_新结构的疏水相互作用。单体A类Tim50_new结构属于II组，以青色显示。相邻分子的N-末端富含脯氨酸的环显示为绿色。标记参与相互作用的N-末端富含脯氨酸环的残基Pro187和Tyr188、B2和B3的残基Trp207和Trp213以及A2的残基Tyr244。

对于Tim50_new的I族成员，通过晶体堆积产生的相邻分子的螺旋A1占据了假定的预序列结合槽（图3一). 相邻分子的螺旋A1位于凸出物之间β-发夹和螺旋A2，并沿着Tim50（164–361）的假定预序列绑定槽的长尺寸延伸。相邻分子的螺旋A1主要对接在假定的预序列结合槽中通过疏水相互作用。来自邻近分子螺旋A1的Tyr223从突起处与Trp207和Trp213进行广泛的疏水相互作用β-发夹。Trp207和Trp213位于β-发夹并沿相反方向摆动以容纳来自相邻分子的Tyr223。此外，来自邻近分子螺旋A1的Tyr227使疏水相互作用来自螺旋A2的Tyr244。来自邻近分子螺旋A1的Gln230与来自螺旋A2的Asn240形成氢键。I组单体的假定预序列结合槽与相邻单体的螺旋A1之间的相互作用代表了这两个单体之间的唯一接触。

据报道，N末端线粒体靶向前序列形成一个两性恋的螺旋与TOM复合体中的Tom20受体相互作用以启动蛋白质移位（Abe等。, 2000). 前序列与Tom20受体之间的关联是通过疏水相互作用介导的。我们认为，来自邻近分子的螺旋A1可能会模拟前序列，与膜间空间内TIM23复合体中的Tim50受体相互作用。类似于前序列和Tom20之间结合的性质，Tim50也与前序列螺旋的疏水侧相互作用。

对于Tim50_new的II族成员，前序列结合囊被相邻单体的N-末端富含脯氨酸的环所占据（图3b条). 富含脯氨酸的环形成一个急转弯，主要通过疏水相互作用与假定的预序列结合沟相互作用。富含脯氨酸环的Pro187和Tyr188从突起处与Trp207和Trp213进行疏水性相互作用β-螺旋A2的发夹和Tyr244（图3b条).

我们的数据表明β-发夹和附近的螺旋A2在识别线粒体前蛋白的前序列并与之相互作用中起着重要作用。大的疏水残基Trp207和Trp213都位于突出物的内侧（朝向假定的预序列结合槽）β-发夹，使这一侧β-发夹相当疏水。据报道β-发夹代表Tim50分子表面最大的保守区（Qian等。, 2011). Tim50的序列比对表明，Trp207和Trp213在不同物种之间非常保守（Qian等。, 2011). 很可能突出物的内侧β-Tim50 IMS结构域的发夹负责通过疏水相互作用识别前序螺旋。凸出物的结构塑性β-发夹和附近的螺旋A2可能有助于Tim50调节不同大小的预序列。

结构和诱变分析表明，Tim50的保守残基Arg214和Lys217可能与Tim23的IMS结构域（Qian等。, 2011). 有趣的是，残留物Arg214和Lys217位于突出物的外侧（背对假定的预序结合槽）β-发夹。因此β-发夹可能在Tim50的功能中发挥关键作用。这个的内侧β-发夹负责识别前序螺旋的疏水表面，而β-发夹参与招募Tim23进行后续蛋白质转运。此外，突出的β-Tim50的发夹具有显著的结构灵活性，有助于其绑定到Tim23的预序列和IMS域。有趣的是，核磁共振波谱分析表明Tim23的IMS结构域也具有内在的灵活性（de la Cruz等。, 2010). Tim23的IMS域在Tim50的前序列结合位点附近与Tim50相互作用，导致假设Tim50和Tim23形成复合前序列结合囊。这也使得预蛋白从Tim50转移到Tim23更加方便。

以前曾有报道将晶体堆积作为正确预测蛋白质-肽相互作用位点的工具（Sha等。, 2000). 在本研究中，由于晶体堆积，Tim50的假定预序列结合槽被螺旋A1和相邻单体的N末端富含脯氨酸环占据。这种结合主要是通过疏水相互作用介导的，并可能在突起处产生构象变化β-发夹和附近的螺旋A2。我们认为来自相邻单体的螺旋A1可能会模拟预序列螺旋，对接到假定的Tim50预序列结合槽中通过疏水相互作用。数据表明，前蛋白受体Tim50在假定的序列前结合沟内，特别是在突起处，具有显著的结构可塑性β-发夹和附近的螺旋A2，以接收预序列。作为比较，在来自TOM复合物的前蛋白受体Tom70中也观察到了结构可塑性（Li等。, 2009, 2010).