1.简介

2003年至2004年间，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）在全球范围内引发疫情，并对受疫情影响的国家产生了重大经济影响（赖，2003）). 2004年，另一种甲型冠状病毒，人类冠状病毒NL63（HCoV-NL63），是从荷兰一名患有细支气管炎和结膜炎（Pyrc等。, 2004). 2005年，Woo及其同事发现了新型β冠状病毒人冠状病毒HKU1呼吸道感染患者（Woo等。, 2005). 最近，中东呼吸综合征冠状病毒在中东（Woo等。, 2014). 与所有冠状病毒感染的情况一样，目前还没有有效的治疗方法可用于治疗冠状病毒疾病，因此开发抗冠状病毒化合物是当务之急。围绕核衣壳的病毒粒子包膜包含以下结构蛋白：S（穗）、M（基质）、E（包膜）和N（核衣壳）。其中一些病毒含有第三种糖蛋白，HE（血凝素酯酶），存在于大多数α冠状病毒中。HCoV N蛋白的主要功能是识别作为包装信号的RNA片段，并在组装过程中形成核糖核蛋白（RNP）复合物（Chang等。, 2014). RNP在保持RNA的有序构象以适合病毒基因组的复制和转录方面可能很重要（Lai，2003; 纳尔逊等。, 2000; 黄等。, 2004; Navas-Martín和Weiss，2004年). 此外，N蛋白已被确定为一个重要的诊断标记和感染宿主中最“免疫显性”的抗原（Chan等。, 2005; 求爱等。, 2004; 梁等。, 2013).

MERS-CoV的N蛋白分子量为45.6 kDa，pI为10.05，具有高度碱性和亲水性（Woo等。, 2014). 先前的研究表明，冠状病毒的N末端结构域（NP-NTD）主要含有带正电荷的残基，这些残基负责RNA结合，而C末端结构域主要起着齐聚形成衣壳的模块（黄等。，2009年; 赛卡通杜等。, 2007; Lo（低）等。, 2013; 陈等。, 2013). N蛋白的中心无序区也被证明含有RNA结合区（Chang等。，2009年). 我们已经证明，与NP-NTD结合并干扰NP–RNA相互作用的化合物为抗冠状病毒疗法的发展提供了有价值的线索（Lin等。, 2014). 几个NP-NTD的晶体结构，包括来自SARS-CoV的那些，传染性支气管炎病毒（IBV），人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）和小鼠肝炎病毒（MHV），已被描述（Chen等。, 2013; 妈妈等。, 2010; 赛卡通杜等。, 2007; 贾亚拉姆等。, 2006; 于等。, 2006; 风扇等。, 2005). 为了阐明MERS-CoV的N蛋白与核酸，我们已经确定晶体结构MERS-CoV N末端结构域的跨残基39–165，与SARS-CoV的NP-NTD具有58%的同源性。本文的结果主要涉及MERS-CoV NP-NTD的结晶和初步的X射线结构分析。

2.材料和方法

2.1. 高分子生产

MERS-CoV N蛋白的模板购自台湾台中AllBio Science Incorporated。重组MERS-CoV NP-NTD的截短形式由聚合酶链反应使用不同的引物对编码N-蛋白基因的pGENT质粒进行（PCR）。PCR产物用NdeI和XhoI消化，DNA片段用T4连接酶（NEB）克隆到pET-28a（Novagen）中。通过将IPTG添加到最终浓度为1 m的溶液中来启动蛋白质的表达M（M）然后在10°C下培养24小时。通过离心（8000转/分）收集细菌后⁻¹，12 min，4°C），将细菌颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中（50 mM（M）三氯化氢，150 mM（M）氯化钠，15米M（M）咪唑，1米M（M）PMSF pH值7.5），并在冰上用3 s脉冲和6 s暂停共10 min的超声波进行溶解。离心后从上清液中获得可溶性蛋白质（13000转/分⁻¹，40分钟，4°C）。携带N末端His的NP-NTD₆使用Ni–NTA柱（Novagen）纯化融合到SSGLVPRGSHM连接序列的标签，并用15–250 m的缓冲咪唑梯度洗脱M（M）在～150 m处收集含有纯蛋白质的组分M（M）咪唑和50米透析M（M）pH 7.5的三缓冲溶液，含150 mM（M）NaCl在4°C下保持3小时（图1). 使用Amicon Ultra离心过滤装置进一步浓缩纯化的NP-NTD，并在3500℃下离心克在4°C下持续10分钟，数次，直到NP-NTD浓度达到10 mg ml⁻¹由Bradford方法（BioShop Canada Inc.）确定。表1总结了大分子生产信息.

表1 大分子生产信息 源生物 中东呼吸综合征冠状病毒 DNA来源 MERS-CoV N蛋白的模板由台湾台中AllBio Science公司提供。MERS-CoV N蛋白的引物由台湾新北市基因组生物科技有限公司提供。 正向底漆 CTTATCG公司CATATG公司AACACCGTAGCTGTATACCGGC公司 反向底漆 CTTACGG公司CTCGAG公司全球气候变化框架 克隆载体 pET-28a（诺瓦根） 表达式向量 pET-28a（诺瓦根） 表达式宿主 大肠杆菌BL21（DE3）pLysS 所产生结构的完整氨基酸序列 HHHHH SSGLVPRGSHMNTVSWYTGLTQHGKVPLPLTPPGQGVPLPLPGGGGGPLNANSTPAQNAGYWRRQDRKINTGNGIKQLAPRWYTYTGTGPEALPFRAVKDGIVVHEDGATDAPSTFGTRNPNNDSAIVTQFAPGTKFPKLPKLNHIEGT

图1 考马斯亮蓝染色的MERS-CoV NP-NTD的SDS-PAGE分析。车道M（M），蛋白质分子质量标记（以kDa标记）；通道1，透析后浓缩MERS-CoV NP-NTD；车道2，净化MERS-CoV NP-NTD。

2.2. 结晶

如前所述，初始结晶条件通过使用坐滴蒸汽扩散法和分子尺寸晶体筛选试剂盒（Till等。, 2013; 陈等。, 2014). 将来自晶体筛选试剂盒的每个溶液（2µl）与2µl纯化蛋白溶液（10 mg ml）混合⁻¹)并允许在室温（～25°C）下与井内300µl溶液进行平衡。通过平衡2µl蛋白质溶液（10 mg ml⁻¹)和2µl储层溶液与300µl由2 m组成的储层溶液对比M（M）溴化钠，75米M（M）硫酸铵，29%PEG 3350（Sigma）。晶体在两周内出现，针簇中最大的晶体尺寸约为300×20×10µm（图2). 结晶信息汇总在表2中.

表2 结晶 方法 蒸汽扩散 板材类型 24井坐式滴板（Hampton Research） 温度（K） 293 蛋白质浓度（mg ml−1) 10 蛋白质溶液的缓冲液成分 50米M（M）Tris–HCl pH 7.5，75 mM（M）氯化钠 储层溶液的组成 2米M（M）溴化钠，75米M（M）硫酸铵，29%PEG 3350 体积和落差 1:1; 将2µl储液罐溶液与2µl纯化蛋白溶液混合 储液罐容积（µl） 300

图2 采用坐滴气相扩散法获得MERS-CoV NP-NTD晶体。针簇中最大的晶体尺寸约为300×20×10µm。

3.结果和讨论

本研究选择的MERS-CoV NP-NTD晶体衍射到2.63º分辨率（图3)并且属于空间组 P（P）2₁，带有单位-细胞参数一= 35.60,b=109.64，c（c）= 91.99 Å,β= 101.22°. 马修斯系数为2.63Ω^三 Da公司⁻¹使用计算MATTHEWS_COEF公司从中央对手方清算所4（优胜者等。, 2011; 马修斯，1968年)表明非对称单元溶剂含量为59.2%。使用爆炸服务器(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi网站). 模型选择标准基于电子-值和估计的精度值。序列比对搜索表明，MERS-CoV NP-NTD与冠状病毒的其他NP-NTD具有高度同一性（补充图S1）。例如，MERS-CoV NP-NTD（残基39–165）与SARS-CoV NP-NTD具有58%的序列同源性。SARS-CoV的NTD（PDB条目2赫兹; 赛卡通杜等。, 2007)被选为其初始模型电子-值为1×10⁻²³，共建模116个残基。第一次分子置换试验是使用佩龙日本RIKEN SPring-8中心蛋白质构造平台（PTP）的自动化接口等。, 2008). 模型的核心由一个紧密封装的β-被大环包围的薄板。然后将分子置换方法应用于模型，使用MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年)使用分辨率范围为8.5–3.0°的反射。四个NP-NTD分子的单一且明确的溶液非对称单元在旋转和平移函数中获得，得到最终结果相关系数0.81和anR（右）系数为0.32。结构精炼MERS-CoV NP-NTD目前正在进行中。

图3 MERS-CoV NP-NTD的典型X射线衍射图。