Crystallization and diffraction analysis of the SARS coronavirus nsp10–nsp16 complex

Debarnot, C.; Imbert, I.; Ferron, F.; Gluais, L.; Varlet, I.; Papageorgiou, N.; Bouvet, M.; Lescar, J.; Decroly, E.; Canard, B.

doi:10.1107/S1744309111002867

结晶通信\（第5em段）

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第67卷| 第3部分| 2011年3月| 第404-408页

doi:10.1107/S1744309111002867

结晶和衍射分析SARS冠状病毒nsp10–nsp16复合物

^一法国马赛CEDEX 09，Luminy大道163号，UMR 6098，病毒结构设计与功能，以及^b条新加坡南洋理工大学生物科学学院，新加坡南洋大道60号，邮编637551
^*通信电子邮件：etienne.decroly@afmb.univ-mrs.fr,bruno.canard@afmb.univ-mrs.fr

(收到日期：2010年11月19日； 2011年1月21日接受；在线2011年2月25日)

迄今为止，SARS冠状病毒是唯一已知的高致病性人类冠状病毒。2003年，它导致了一场大规模疫情，病死率为10%。这种阳性RNA病毒编码一个由16个基因产物（nsp1-16）组成的大复制酶多聚蛋白，其中两个甲基转移酶nsp14和nsp16与病毒有关信使核糖核酸盖层形成。这个晶体结构nsp16是未知的。Nsp16是一种RNA-cap AdoMet依赖性（核苷2′-O（运行）-)-甲基转移酶，仅在nsp10存在时有效。本文报道了nsp10与nsp16复合物的表达、纯化和结晶。晶体衍射到1.9°分辨率晶体结构决定正在进行中。

关键词： SARS 冠状病毒;nsp10基因;国家标准16.

1.简介

2003年，一种新型病毒在中国爆发，并在几个国家传播。经鉴定的病毒是一种以前未知的冠状病毒，命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）。与其他冠状病毒一样，SARS-CoV有一个约30 kb的RNA基因组，带有5′帽和3′多聚（a）尾（Snijder等。, 2003 ). SARS-CoV的基因组编码两个大的多蛋白1a和1ab，这两个蛋白至少由两种病毒进行自身蛋白水解处理蛋白酶，产生16种非结构蛋白。这些nsp被认为形成一个巨大的蛋白质复合体，负责病毒RNA的复制和转录。此外，一组编码结构蛋白和辅助蛋白的亚基因组mRNA是由一种复杂的机制产生的，包括嵌套信使核糖核酸使用全长基因组RNA作为模板进行合成。这些mRNAs被认为是被封端和聚腺苷化的（Lai和Stohlman，1981 ; 范弗利特等。, 2002 ).

自2003年以来，对SARS-CoV的兴趣极大地促进了对其nsp的结构和功能研究。近年来，许多复制蛋白的三维结构出现在文献中，包括nsp1（Almeida）的三维结构等。, 2007 ); nsp3的几个结构域[包括（i）N末端富含谷氨酸的酸性结构域（AD；Serrano等。, 2007 )，（ii）X域（XD；Egloff等。, 2006 )，（iii）SUD域（SARS-CoV唯一域；Chatterjee等。, 2009 )和（iv）木瓜蛋白酶样PLP2（Ratia等。, 2006 )]; nsp5（阿南德等。, 2002 ); 由nsp7–nsp8（翟）组成的复合体等。, 2005 ); RNA-结合蛋白nsp9（Egloff等。, 2004 ); 锌结合蛋白nsp10（约瑟夫等。, 2006 ，苏等。, 2006 ); 和六聚RNA内切酶nsp15（Ricagno等。, 2006 ). 在许多情况下，晶体结构使科学家能够提出或确定nsps的生物化学功能，如nsp7–nsp8，它是一种RNA依赖性RNA原酶（Imbert等。, 2006 )以及nsp15内切酶，其活性位点与RNA酶A活性位点（Ricagno等。, 2006; 约瑟夫等。, 2007 ). 然而，RNA封顶的过程尚未从这种结构工作中受益信使核糖核酸加盖。

在真核生物中，信使核糖核酸capping是由作用于5′端的一系列三到四个典型反应产生的mRNA。新生的信使核糖核酸转录物经历有限的去磷酸化，其中最后的5′-磷酸被5′-RNA三磷酸酶去除。鸟苷酰转移酶（也称为盖酶）将GMP分子以5′到5′的方向连接到5′-二磷酸RNA上。然后，通过N7-鸟嘌呤甲基转移酶，将被封盖的RNA在封盖鸟氨酸核苷酸的N7位置甲基化。这产生了cap-0结构(^7米GpppNN…）主要存在于酵母和低等真核生物中。在高等真核生物和植物中，第二个甲基转移酶作用于第一个转录核苷酸的2′-O位置，产生cap-1结构(^7米GpppN公司_2英尺宽N…），例如在冠状病毒信使核糖核酸上发现的（Lai&Stohlman，1981; 范弗利特等。, 2002).

我们最近鉴定了RNA帽2′-O（运行）-SARS-CoV甲基转移酶（Bouvet等。, 2010 ; 卢加里等。, 2010 ). 正如信号序列分析预测的那样，nsp16隐藏了这种活性；然而，该酶只有在nsp10存在时才有活性。后者已被证明使用酵母双氢化物方法与nsp16强烈相互作用，这表明这些酶结合成一个足以耐受纯化的复合物（Imbert等。, 2008 ).

在这里，我们报道了nsp10和nsp16在原核表达载体中的克隆。在这两个基因表达后，由nsp10和nsp16（nsp10–nsp16）组成的稳定复合物可以被纯化和结晶。我们提供了这些SARS-CoV nsp10–nsp16晶体的X射线衍射数据。

2.材料和方法

2.1. nsp10和nsp16严重急性呼吸系统综合征冠状病毒基因的串联克隆

SARS-CoV的法兰克福1号分离物（GenBank登录号AY291315；Thiel等。, 2003 )在Vero-E6细胞中扩增并用于产生nsp10–nsp16复合物，如下所示：编码SARS-CoV nsp10（139个氨基酸，14.84 kDa）和nsp16（298个氨基酸，33.5 kDa大肠杆菌Bruno Coutard博士（法国AFMB）善意提供的双表达质粒，包含两个单独的启动子。在这个主干中，SARS-CoV nsp10在tetA标准启动子并编码与N末端融合的蛋白质斯特雷普-Tag（八个氨基酸；WSHPQFEK）和nsp16在T7下表达紫胶启动子并编码与N末端六组氨酸标签（Bouvet等。, 2010). 该系统通过添加不同浓度的四环素和IPTG（异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷）。

2.2. nsp10–nsp16复合物的表达和纯化

SARS-CoV nsp10–nsp16在大肠杆菌携带pLysS质粒（Novagen）的菌株C41（DE3）（Avidis SA，法国）。培养物在310K下生长，直到OD_600纳米达到0.6。通过添加50µM（M）IPTG和200µg l⁻¹脱水四环素和细胞在297 K下孵育16小时。细菌细胞颗粒通过6000℃离心收集克，冻结并重新悬浮在裂解缓冲液中（50 mM（M）HEPES pH值7.5300 mM（M）氯化钠，5米M（M）硫酸镁₄)补充10µg ml⁻¹DNase I.细胞在100 MPa和277 K（英国恒细胞）下破碎并在20000离心澄清后克将可溶性蛋白部分与斯特雷普-Tactin Sepharose（IBA生物技术）。在缓冲器中进行三次清洗（50 mM（M）HEPES pH值7.5500 mM（M）氯化钠，1米M（M）TCEP，5米M（M）氯化镁₂)结合蛋白在补充有2.5m的洗涤缓冲液中洗脱M（M） D类-去硫生物素。

2.3. 结晶和衍射分析

Stura Footprint Screen、JCSG+Screen和Structure Screen I和II（分子尺寸）在CrystalQuick平板中进行了试验，每个储层有三个孔（Greiner Bio-One），使用400、300和200 nl滴液。滴液中含有浓度为5.4 mg ml的不断增加的蛋白质溶液（100、200和300 nl）⁻¹洗脱缓冲液中（50 mM（M）HEPES pH值7.5500 mM（M）氯化钠，1米M（M）TCEP，5米M（M）氯化镁₂，2.5米M（M） D类-去硫生物素）和恒定体积的沉淀剂。在0.1中观察到命中情况M（M）bicine pH值9，2M（M）氯化镁₂一周后。在293 K的温度下，通过气相扩散法在Linbro板中进行结晶优化（Hampton Research）。将2µl滴液（由1.5µl蛋白质溶液和0.5µl沉淀剂溶液组成）与1 ml储液罐溶液进行平衡。晶体生长条件的优化导致以下条件：0.1M（M）CHES pH值9，1.52M（M）氯化镁₂晶体在24小时后出现，可见生长在48–72小时后停止。在氮气气流（牛津晶体系统）中将晶体冷却至100 K之前，将晶体短暂浸泡在含15%的冷冻保护剂中(五/五)添加到母液中的甘油。使用SOLEIL同步辐射设施光束线PROXIMA 1上的ADSC Quantum 315 3×3阵列探测器或欧洲同步辐射设施束线ID14-EH1上的ADSCQuantum 210 2×2阵列探测器记录本地衍射数据。数据处理使用XDS公司（卡布施，2010年 )和缩放比例标量（合作计算项目，第4期，1994年）). 表1总结了晶体参数和数据收集统计数据.

表1
数据收集和处理统计

括号中的值表示最高分辨率外壳。

晶体数量	1
光束线	PROXIMA 1（SOLEIL同步加速器）
波长（Ω）	0.979
探测器	ADSC Q315r公司
晶体到探测器的距离（mm）	256.35
每张图像的旋转范围（°）	1
总旋转范围（°）	90
每张图像的曝光时间（s）	1
分辨率范围（Ω）	37.52–2.00 (2.11–2.00)
“空间”组	C类222₁
单位-细胞参数（Ω，°）	一= 68.1,b条= 184.6,c（c）= 128.8,α=β=γ= 90.00
镶嵌度（°）	0.097
测量强度的总数	273149
独特的反射	54947 (7963)
多重性	3.7 (3.7)
平均值我/σ(我)	7.5 (3.2)
完整性（%）	99.7 (100)
R（右）_合并†	0.114 (0.430)
R（右）_测量	0.136 (0.500)
总体B类Wilson图中的因子（λ²)	37.3

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_}|i_{i}（hkl）-\langle i（hk1）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ ，其中我_我(香港特别行政区)是我反射观测香港特别行政区和我(香港特别行政区)\9002；是所有反射观测的加权平均强度香港特别行政区.

2.4. 纯化nsp10–nsp16复合物的交联

50 m内纯化的nsp10–nsp16复合物（4µg）M（M）HEPES pH 7.5，150 mM（M）氯化钠，5米M（M）氯化镁₂，1米M（M）TCEP和5%甘油在277 K下与亚油酸双溶液孵育过夜(N个-羟基琥珀酰亚胺酯）（SAB；Sigma），浓度为0.005%。然后用等体积的2×解离缓冲液[100mM（M）Tris–HCl pH 6.8，20%甘油和200 mM（M）DTT、4%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.2%溴酚蓝]。在368 K下加热5分钟后，在SDS NuPAGE 4–12%凝胶（Invitrogen）上分离并分析蛋白质。

3.结果和讨论

3.1. 稳定的nsp10–nsp16复合物的表达、纯化和结晶

实验室中许多单独结晶nsp16的尝试仍然失败。尽管单独表达时可以获得大量（毫克级）nsp16，但该蛋白在各种缓冲液和沉淀中在不同的存储条件下是不稳定的。此外，尽管信号序列分析明确确定了SAM依赖的甲基转移酶折叠（von Grotthuss等。, 2003 ; 德克雷利等。, 2008 )仅SARS-CoV nsp16不具有这种酶活性。相反，nsp10在大肠杆菌可以很容易地被纯化和结晶。2006年发表了两种nsp10晶体形式的结构：一种揭示了单体和二聚体（约瑟夫等。, 2006)分辨率为1.8º（PDB条目第二季度)，而分辨率为2.1º的复杂十二元结构（PDB条目2克9吨)当nsp10表达并结晶为与nsp11融合时（Su等。, 2006). 然而，还没有预测或证明nsp10的功能，nsp10是一种锌结合蛋白。

我们已经报道了nsp10和nsp16相互作用在体外当在酵母中共同表达时（Imbert等。, 2008)或细菌（布韦等。, 2010). 这一观察促使我们在原核表达载体中共同表达这两种蛋白，并尝试纯化复合物。Nsp10是在tetA标准与a融合的启动子斯特雷普-将其N末端的标签肽和其N末端用六组氨酸标签标记的nsp16在T7lac公司发起人。转化为细菌菌株C41后，在297 K下，通过添加IPTG和四环素16 h诱导蛋白表达。细菌裂解物被澄清，nsp10被吸附在斯特雷普-塔克汀Sepharose珠。经过几次洗涤，蛋白质与斯特雷普-他汀用2.5 m洗脱M（M）生物素类似物去硫生物素。通过SDS–PAGE分析，我们检测到斯特雷普-nsp10和他的₆-nsp16蛋白分别在15和35 kDa左右迁移，这表明这两种蛋白已被共同纯化（图1). 纯化复合物的总收率通常为每升1毫克大肠杆菌文化。蛋白质浓度估计和分子量归一化表明，蛋白质的比例约为1:1。

图1
SARS-CoV nsp10与nsp16复合物的纯化。纯化的SARS-CoV nsp10–nsp16复合物通过12%SDS–PAGE分析并使用考马斯蓝染色。Lane MK，分子量标记；通道1，2µg nsp10–nsp16蛋白复合物从条纹-塔克汀柱。

3.2. nsp10–nsp16复合物的表征

在尝试确定结晶条件之前，对nsp10–nsp16复合物进行了进一步表征。我们首先通过基质辅助激光解吸电离飞行时间确认了每个重组蛋白的身份质谱法凝胶内胰蛋白酶消化后（数据未显示）。我们还分析了从斯特雷普-Tactin列尺寸排除色谱法。图2(一)显示了凝胶过滤洗脱曲线。我们观察到稳定的nsp10–nsp16复合物以对应于50kDa的单峰形式洗脱。通过交联实验也证实了nsp10和nsp16之间的相互作用。为此，将nsp10–nsp16复合物与0.005%SAB培养，SAB是一种与赖氨酸残基特异反应的交联试剂。在SDS–PAGE分离后，我们检测到与nsp10和nsp16单体相对应的带，以及与迁移约50 kDa的nsp10–nsp16复合物相对应的附加带（图3中的X通道b条). 甲基转移酶分析也证明了复合物中存在nsp16（Selisko等。, 2010 )结果表明，含有nsp10–nsp16复合物的纯化部分表现出2′-O（运行）-短N7-甲基化封端RNA底物上的甲基转移酶活性（Bouvet等。, 2010). 总之，这些结果表明，我们开发了一种方法，可以通过一步程序生产和纯化活性nsp10–nsp16复合物。该蛋白制剂用于晶体生长时无需额外处理。

图2
SARS-CoV nsp10与nsp16复合物的特性。(一)凝胶过滤色谱图SARS-CoV nsp10–nsp16复合物。nsp10–nsp16复合物从斯特雷普-Tactin柱在16/60 S200凝胶过滤柱上进行分析，蛋白质和核酸洗脱后分别在280 nm（蓝色）和260 nm（橙色）下测量吸收。90 ml后的主峰洗脱对应于50 kDa蛋白质的洗脱。(b条)交联实验。将纯化的SARS-CoV nsp10–nsp16复合物装载到4–12%NuPAGE凝胶上，并使用考马斯蓝染色。Lane MK，分子量标记；通道1，4µg非交联nsp10–nsp16复合物，通道2，4μg使用0.005%SAB交联剂在277 K下培养过夜的nsp10-nsp16复合体。

图3
(一)SARS-CoV nsp10–nsp16复合物的优化晶体。标尺长度为100µm。(b条)优化晶体中nsp10–nsp16复合物的NuPAGE分析。将十个优化的晶体加载到4-12%的NuPAGE凝胶上，并使用考马斯蓝染色。Lane MK，分子量标记；Xtal巷，nsp10–nsp16复合体。(c（c）)SARS-CoV nsp16–nsp10蛋白复合物晶体的X射线衍射图。显示了分辨率弧。观察到反射低于2°（插图中显示了放大）。

3.3. 晶体生长和数据收集

该复合物最初使用0.1结晶M（M）bicine pH值9，2M（M）氯化镁₂（条件E2来自结构屏幕I和II）。然后优化晶体生长，最终选择最佳条件为0.1M（M）CHES pH值9，1.52M（M）氯化镁₂晶体通常在夜间出现，48–72小时后可见生长停止（图3一). 为了确认晶体中含有nsp10–nsp16复合物，我们收集了10个晶体，在两次洗涤后通过SDS–PAGE进行分析。图2(b条)结果表明，在考马斯蓝染色中检测到nsp10和nsp16两种蛋白。这证实了晶体由nsp10–nsp16络合物组成，其化学计量与结晶前观察到的化学计量相似。

晶体在添加15%的相同缓冲液中闪蒸冷却(五/五)甘油暴露于同步辐射X射线前。典型的衍射图像如图3所示(c（c）)，其中反射以2º分辨率可见。数据整合和还原表明，这些晶体属于空间组 C类222₁，每个有一个复合体非对称单元（表1). 晶体（空间组C类222₁，unit-cell参数一= 68.1,b条= 184.6,c（c）=128.8¦Μ），每个含有一个nsp10–nsp16复合物非对称单元，溶剂含量70%V（V）_M（M）4.17Ω的值^三 Da公司⁻¹.

4.结论

我们已经结晶出SARS-CoV nsp10和nsp16蛋白的复合物。复合物中nsp10的存在赋予2′-O（运行）-nsp16的甲基转移酶活性。这个晶体结构nsp10的已知，而nsp16的未知。考虑到这里描述的晶体的质量以及nsp10是一种锌结合蛋白的事实，应该可以确定晶体结构利用Zn原子的定相能力，使用分子置换技术与SAD研究获得的相合并。

致谢

这项工作在最初阶段得到了欧盟第六框架的VIZIER综合项目（LSHG-CT-2004-511960）的支持，随后又得到了法国国家研究机构（参考号ANR-08-MIEN-032）的支持卑诗省政府和警署指示（合同07co404）。梅赛德斯-奔驰（MB）拥有一个来自格内拉尔（Générale de l’Amement）方向的奖学金。

工具书类

Almeida，M.S.、Johnson，M.A.、Herrmann，T.、Geralt，M.&Wüthrich，K.（2007年）。J.维罗尔。 81, 3151–3161. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Anand，K.、Palm，G.J.、Mesters，J.R.、Siddell，S.G.、Ziebuhr，J.和Hilgenfeld，R.（2002）。EMBO J。 21, 3213–3224. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Bouvet，M.、Debarnot，C.、Imbert，I.、Selisko，B.、Snijder，E.J.、Canard，B.和Decroly，E.（2010年）。《公共科学图书馆·病理学》。 6，e1000863科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Chatterjee，A.，Johnson，M.A.，Serrano，P.，Pedrini，B.，Joseph，J.S.，Neuman，B.W.，Saikatendu，K.，Buchmeier，M.J.，Kuhn，P.&Wüthrich，K.（2009年）。J.维罗尔。 83, 1823–1836. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 协作计算项目，第4期（1994年）。《水晶学报》。D类50, 760–763. 交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Decroly，E.、Imbert，I.、Coutard，B.、Bouvet，M.、Selisko，B.、Alvarez，K.、Gorbalenya，A.E.、Snijder，E.J.和Canard，B.（2008）。J.维罗尔。 82, 8071–8084. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Egloff，M.P.、Ferron，F.、Campanacci，V.、Longhi，S.、Rancurel，C.、Dutartre，H.、Snijder，E.J.、Gorbalenya，A.E.、Cambillau，C.和Canard，B.（2004年）。程序。美国国家科学院。科学。美国,101, 3792–3796. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Egloff，M.P.、Malet，H.、Putics，A.、Heinonen，M.、Dutartre，H.，Frangeul，A.、Gruez，A.、Campanachi，V.、Cambilau，C.、Ziebuhr，J.、Ahola，T.和Canard，B.（2006年）。J.维罗尔。 80, 8493–8502. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Grotthuss，M.von，Wyrwicz，L.S.&Rychlewski，L.（2003）。单元格,113, 701–702. 科学网公共医学谷歌学者
 Imbert，I.、Guillemot，J.C.、Bourhis，J.M.、Bussetta，C.、Coutard，B.、Egloff，M.P.、Ferron，F.、Gorbalenya，A.E.和Canard，B.（2006）。EMBO J。 25, 4933–4942. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Imbert，I.、Snijder，E.J.、Dimitrova，M.、Guillemot，J.C.、Lécine，P.&Canard，B.（2008）。病毒研究。 133, 136–148. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Joseph，J.S.、Saikatendu，K.S.、Subramanian，V.、Neuman，B.W.、Brooun，A.、Griffith，M.、Moy，K.、Yadav，M.K.、Velasquez，J.、Buchmeier，M.J.、Stevens，R.C.和Kuhn，P.（2006）。J.维罗尔。 80, 7894–7901. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Joseph，J.S.、Saikatendu，K.S.、Subramanian，V.、Neuman，B.W.、Buchmeier，M.J.、Stevens，R.C.和Kuhn，P.（2007）。J.维罗尔。 81, 6700–6708. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Kabsch，W.（2010年）。《水晶学报》。D类66, 125–132. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Lai，M.M.和Stohlman，S.A.（1981年）。J.维罗尔。 38, 661–670. 中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Lugari，A.、Betzi，S.、Decroly，E.、Bonnaud，E.、Hermant，A.、Guillemot，J.C.、Debarnot，C.、Borg，J.P.、Bouvet，M.、Canard，B.、Morelli，X.和Lécine，P.（2010）。生物学杂志。化学。 285, 33230–33241. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Ratia，K.、Saikatendu，K.S.、Santarsiero，B.D.、Barretto，N.、Baker，S.C.、Stevens，R.C.和Mesecar，A.D.（2006年）。程序。美国国家科学院。科学。美国,103, 5717–5722. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Ricagno，S.、Egloff，M.P.、Ulferts，R.、Coutard，B.、Nurizzo，D.、Campanacci，V.、Cambillau，C.、Ziebuhr，J.和Canard，B.（2006年）。程序。美国国家科学院。科学。美国,103, 11892–11897. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Selisko，B.、Peyrane，F.F.、Canard，B.、Alvarez，K.和Decroly，E.（2010年）。《病毒遗传学杂志》。 91, 112–121. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Serrano，P.，Johnson，M.A.，Almeida，M.S.，Horst，R.，Herrmann，T.，Joseph，J.S.，Neuman，B.W.，Subramanian，V.，Saikatendu，K.S.，Buchmeier，M.J.，Stevens，R.C.，Kuhn，P.&Wüthrich，K.（2007）。J.维罗尔。 81, 12049–12060. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Snijder，E.J.、Bredenbeek，P.J.、Dobbe，J.C.、Thiel，V.、Ziebuhr，J.、Poon，L.L.、Guan，Y.、Rozanov，M.、Spaan，W.J.和Gorbalenya，A.E.（2003）。分子生物学杂志。 331, 991–1004. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Su，D.，Lou，Z.，Sun，F.，Zhai，Y.，Yang，H.，Zhang，R.，Joachimiak，A.，Zhanng，X.C.，Bartlam，M.&Rao，Z.（2006年）。J.维罗尔。 80, 7902–7908. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Thiel，V.、Ivanov，K.A.、Putics，A.、Hertzig，T.、Schelle，B.、Bayer，S.、Weissbrich，B.、Snijder，E.J.、Rabenau，H.、Doerr，H.W.、Gorbalenya，A.E.和Ziebuhr，J.（2003）。《病毒遗传学杂志》。 84, 2305–2315. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Vliet，A.L.van，Smits，S.L.，Rottier，P.J.&De Groot，R.J.（2002）。EMBO J。 21, 6571–6580. 科学网公共医学谷歌学者
 翟毅、孙凤、李旭、彭浩、徐旭、巴特拉姆、M.和饶总（2005）。自然结构。分子生物学。 12, 980–986. 科学网交叉参考中国科学院谷歌学者

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