1.简介

2003年，中国突然爆发了一场严重急性呼吸系统综合征（SARS）疫情，并在全球范围内迅速蔓延，造成8000多人死亡。SARS的病原学特征为冠状病毒SARS-CoV。该病毒有一个约30 kbp长的单链RNA基因组，带有5′帽和3′多聚（a）尾（Rota等。, 2003).

SARS-CoV的基因组编码两个大的多蛋白1a和1ab，包括复制酶成分。这些多肽由两种病毒进行自身蛋白水解蛋白酶，产生16个非结构蛋白（Nsps），与许多加工中间体和宿主蛋白一起，被认为形成一个巨大的蛋白质复合体，负责病毒的复制和转录。尽管人们对冠状病毒越来越感兴趣，但非结构蛋白的生物化学和结构表征仍然滞后。在过去的两年里，尽管世界范围内做出了巨大的努力，但仅报道了Nsps的三种X射线结构：主要蛋白酶Nsp5的X射线结构、新型RNA-结合蛋白Nsp9的X光结构和复合物Nsp7-Nsp8（Anand等。, 2003; 埃格洛夫等。, 2004; 萨顿等。, 2004; 翟等。, 2005).

冠状病毒Nsps的一些异常活性已被鉴定，与其他RNA病毒中发现的不同，Nsp15就是一个显著的例子。比较基因组学已经可以确定Nsp15和另一种蛋白质XendoU之间的相似性，XendoU是一种来自非洲爪蟾卡法雷利研究等。(1997). XendoU参与从宿主前mRNA中加工U16小核仁RNA。它具有多（U）特异性，需要锰²⁺作为辅因子（卡法雷利等。, 1997; 拉内韦等。, 2003). 因此，有人认为Nsp15可能是一种内核糖核酸酶（Snijder等。, 2003)这是RNA病毒世界中独特的鸟巢病毒。

最近报道了SARS Nsp15的生化特性，并测定了其内核糖核溶解活性及其特异性（Bhardwaj等。, 2004; 伊万诺夫等。, 2004). Nsp15的主要活性是在双链RNA中裂解5′到尿苷酸盐，这需要二价阳离子的存在。与其他内核糖核酸酶一样，Nsp15使用锰²⁺作为辅因子；在镁的存在下²⁺或检测到活性较低或没有活性的其他金属阳离子。Nsp15已被证明对RNA具有高度特异性。DNA不被切割，也不抑制RNA消化，因此表明它不与Nsp15结合（Bhardwaj等。, 2004). 单链RNA也被切割，但比双链RNA（Ivanov等。, 2004).电子显微镜和其他生物物理技术一样，Nsp15单体形成了六聚体结构（瓜里诺等。, 2005).

核糖核酸酶分为两类（Saida等。, 2003). 第一组酶的特征是活性部位存在金属离子。在第二组中，使用组氨酸作为总碱，组氨酸或谷氨酸作为总酸（鸢尾等。, 1997; 西川等。, 1987; 斯特亚特等。, 1990; 汤普森等。, 1994). 该反应生成带有环状2′-3′磷酸二酯末端的产物。近期工作（Gioia等。, 2005)表明XendoU和与其相关的病毒内核糖核酸酶不属于上述任何一组。相反，这项研究揭示了一类新的RNA处理酶的存在，这种酶的活性需要金属离子（主要是锰²⁺)，产生环2′-3′磷酸二酯末端，并具有两个组氨酸残基，这两个残基对核糖核酸酶活性至关重要。

Nsp15的生化新颖性和SARS-CoV在医学上的重要性促使我们开始对这种酶进行晶体学研究。全长Nsp15由346个氨基酸组成的多肽链组成，分子量为38.5 kDa。本文报道了SARS-CoV中Nsp15的克隆、表达、纯化和结晶，以及Nsp15晶体的初步衍射实验。

2.表达和纯化

从J.Dobbe和E.J.Snijder（Drosten等。, 2003)使用两个含有Gateway重组系统（Invitrogen）attB位点的引物。编码六组氨酸标签的序列被添加到基因的5′端。根据网关克隆技术（Invitrogen）将cDNA克隆到pDest14质粒中。多参数表达筛选大肠杆菌使用稀疏矩阵（Abergel等。, 2003)然后进行斑点杂交检测程序（Vincentelli等。, 2005). 使用的优化表达式条件大肠杆菌菌株C41（DE3）（Avidis）用pLysS质粒（Novagen）转化并在298 K的Turbo Broth培养基（雅典娜酶）中生长M（M）外径时的IPTG₆₀₀达到0.5。表达每升培养物产生约1.5 mg可溶性Nsp15。通过离心收集细胞并将其重新悬浮在10 ml缓冲液中A类（50米M（M）Tris pH值8，150米M（M）氯化钠，10米M（M）咪唑，1米M（M）PMSF，0.2毫克毫升⁻¹溶菌酶，0.1微克毫升⁻¹DNA酶，20 mM（M）硫酸镁₄和蛋白酶封尾抑制剂；Sigma）每OD₆₀₀单位和每升培养物。通过超声波分解细胞并离心（20000克)在277 K下保持40 min。净化包括两个步骤。首先，在Hisprep柱（Amersham）上进行IMAC（固定化金属离子亲和色谱）。用50 m洗脱蛋白质M（M）三氯化氢，150 mM（M）氯化钠，250米M（M）咪唑，pH 8.0。尺寸排除色谱法使用Superdex 200 HiLoad 26/60（Amersham）在10m内进行M（M）特里斯，50米M（M）氯化钠pH值7.5。瓜里诺（Guarino）也观察到，Nsp15用保留体积洗脱，保留体积对应于约250 kDa的分子量，对应于六聚体缔合等。(2005). 用SDS-PAGE分析蛋白质纯度。使用Amicon Ultra（5000 kDa分子量截止值）浓缩重组蛋白。

3.结晶

蛋白质在用于尺寸排除色谱法浓度不能超过2–3.5 mg ml⁻¹此外，蛋白质必须在纯化后很快结晶，以防止沉淀。微透析实验表明，蛋白质更稳定（i）在6.5至9之间的pH值下，以及（ii）当氯化钠浓度高于300 m时M（M）然而，在这些条件下结晶失败，氯化钠浓度必须降低，最终的蛋白质缓冲液为50 mM（M）氯化钠，10米M（M）Tris pH值7.5。

使用纳米滴注机器人（Cartesian Inc.）在291 K下使用坐滴技术进行结晶试验。Wizard Screens 1和2（Emerald Biostructures）、Structure Screens 1和2以及Stura Footprint Screen（Molecular Dimensions Ltd）用于初始筛选。滴300、200和100 nl蛋白质溶液（1.0–3.5 mg ml⁻¹)与100nl母液混合（储液容量为150µl）。Stura Footprint Screen中的三个条件和Wizard Screens中的一个条件产生了水晶点击。优化后，其中两个条件产生了小立方晶体[10-20%(w个/v（v）)聚乙二醇10 000，0.2M（M）苹果酸咪唑酯pH 8.0–9.0和15–25%(w个/v（v）)聚乙二醇8000，0.1M（M）CHES pH 9.0–10.0]。晶体在2-4天内生长到最大尺寸0.05×0.05×0.05 mm（图1).

图1 SARS-CoV的Nsp15晶体作为脱辅酶结晶。

4.初步晶体学分析

Nsp15晶体在110 K的液氮中进行闪速冷冻。将甘油作为冷冻保护剂添加到母液中，最终浓度为33%。使用MAR 165 CCD探测器，在欧洲同步辐射设施（ESRF，法国格勒诺布尔）光束线ID14-3处收集天然酶的衍射数据。数据处理使用MOSFLM公司/SCALA公司（合作计算项目，第4期，1994年）).

Nsp15晶体对X射线的衍射分辨率极限为2.7º。晶体呈现立方对称，属于两个对映空间群之一P（P）4₁32或P（P）4_三32，带单元间参数一=b条=c=166.8奥（表1). 马修斯系数的计算表明非对称单元可能含有一个或两个Nsp15分子，分别对应75或51%的计算溶剂含量（Matthews，1968). 在使用该程序计算的自转图中搜索双轴时，未发现峰值GLRF公司（Tong&Rossmann，1997）)，从而表明非对称单元包含一个分子。目前没有与Nsp15具有足够序列相似性的结构；结构测定因此，使用硒代蛋氨酸替代蛋白进行MAD/SAD阶段化是必要的，并且已经开始。

表1 X射线衍射数据统计 括号中的值表示最高分辨率外壳（2.85–2.70Ω）。 数据收集 ID14-3、ESRF 波长（nm） 0.931 分辨率（Ω） 59–2.70 观察结果总数 268080 独特的观察结果 39242 完整性（%） 100 (100) 冗余 11.9 (12.2) 平均我/σ(我) 14.5 (4.4) 威尔逊B类因素 50.2 R（右）合并†(%) 17.4 (60.5) †R（右）合并=.