1.简介

冠状病毒是所有阳性标记RNA病毒中基因组最大的病毒。其复制酶基因的翻译导致两个大的多蛋白随后被切割成大量非结构蛋白（16个用于严重急性呼吸综合征冠状病毒；SARS-CoV），其功能是确保基因组和亚基因组RNA合成（Lai和Holmes，2001）; Siddell，1995年; 西德尔等。, 2005). 基因组的特别大可能是因为它编码病毒世界中不寻常的酶活性（斯奈德）等。, 2003). 其中一些蛋白质的确切作用尚未确定（Ziebuhr，2005）).

SARS-CoV nsp3是一种大的（213kDa）多域蛋白，被认为具有与复制复合物有关的多种酶活性，包括宏域，也称为X域（Gorbalenya等。, 1991, 2004; 斯奈德等。, 2003). 迄今为止，已有330个蛋白质被报道拥有这样的结构域（来自SMART数据库；Letunic等。, 2004). 这个宏结构域存在于许多多域蛋白质中，包括一些ssRNA病毒（如风疹病毒、α病毒和一些冠状病毒）的非结构蛋白、一些多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和宏观H2A组蛋白的C末端结构域，但它也可以单独构成一个蛋白质，正如细菌、古细菌和真核生物的情况一样（F.Forouhar、I.Lee、S.M.Vorobiev、R.Xiao、T.B.Acton、G.T.Montelione、J.F.Hunt和L.Tong，未发表的工作；Allen等。, 2003; Shull公司等。, 2005; 莱图尼克等。, 2004). 这种广泛的分布表明在细胞过程中发挥着重要而普遍的作用。

最近几项研究表明宏结构域作为磷酸酶，从ADP-核糖-1〃′-磷酸（Martzen等。, 1999; 卡拉斯等。, 2005; Shull公司等。, 2005; 普蒂奇等。, 2005). 这种活动的作用，尤其是在病毒世界中，仍然令人困惑。我们有兴趣确定病毒的确切作用宏结合酶的特性研究和酶的结构研究，单独或与生物相关分子复合。因此，我们已经启动了Semliki Forest病毒、人冠状病毒229E和SARS冠状病毒的结构和功能表征宏域。在本研究过程中晶体结构另一株SARS-CoV（菌株Tor2）的结构稍有不同，作为载脂蛋白酶被解决并发表（Saikatendu等。, 2005). Tor2蛋白在溶液和晶体中都是二聚体，其结构表明活性部位被二聚体结合物所阻断，这解释了为什么用各种配体浸泡实验无法获得这种特殊的晶体结构。

在这里，我们报道了SARS-CoV Frankfurt 1株单体形式的克隆、表达、纯化、结晶和初步X射线特征宏结构域（一种18.6kDa蛋白质，由nsp3的182-355个氨基酸组成），这可能使配体吸收实验更加成功，从而对病毒的机制提供了一些见解宏域。

2.克隆、表达和纯化

一旦SARS-CoV基因组序列可用，我们就使用VaZyMolO公司（‘病毒酶模块定位’）工具。范围VaZyMolO公司是在大型病毒多蛋白中定义病毒蛋白和蛋白模块，它们可能以可溶性和功能活性形式表达（Ferron等。, 2005). 我们对SARS-CoV基因组编码的蛋白质（非结构、结构和辅助）的注释与Snijder相似等。(2003). 对于nsp3，我们定义了六个独立的域，包括宏域名。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒位于两个特征较差的结构域（即富含谷氨酸的酸性结构域和严重急性呼吸系统综合征特异性独特结构域；SUD）之间宏该领域没有明确的边界。我们在VaZyMolO公司数据库基于多种标准，包括生物信息学方法、对细胞可用三维结构的检查宏结构域和现有生化数据。后者表明，在某些病毒中，N末端边界的定义可能对检测ADP-核糖-1′′-磷酸酶活性特别重要（T.Ahola，个人通信）。从Akos Putics和John Ziebuhr（Putics）友好提供的pMal-SARS-CoV-X质粒中扩增出该结构域的编码序列（包括174个氨基酸，nsp3的182-355个氨基酸，Frankfurt 1分离物，DDB/EMBL/Genbank登录号AY291315）等。, 2005). 用含有Gateway重组系统（Invitrogen）attB位点的两个引物进行PCR扩增。编码六组氨酸标签的序列被添加到基因的5′端。然后在pDest14质粒（Invitrogen）中亚克隆该cDNA。通过测序检查最终结构的开放阅读框（法国图卢兹MilleGen）。

表达式在中执行大肠杆菌菌株C41pROS，我们从罗塞塔菌株（诺瓦根）引入pLys质粒的C41菌株。培养物在310 K和250 K的TB中生长克至中指数阶段（OD₆₀₀第0.6页）。补充100 mg ml培养基⁻¹选择氨苄西林大肠杆菌重组子。通过添加最终浓度为50µ米1-硫代异丙基-β-D类-将吡喃半乳糖苷（IPTG）和细胞在298 K和250 rev min下再培养20 h⁻¹.细胞通过5000离心收集克在277 K的温度下保持20分钟，将细菌颗粒重新悬浮，然后在253 K的温度条件下在50 m内冷冻米Tris–HCl，150米米氯化钠，10米米咪唑pH 8.0（每OD 10 ml₆₀₀单位和每升培养基）。细胞悬浮液解冻，补充1m米PMSF，0.2毫克毫升⁻¹溶菌酶，0.1µg ml⁻¹DNA酶，20 m米硫酸镁₄和蛋白酶混合物抑制剂（Sigma），通过超声裂解并离心（20000克)在277 K下保持40分钟，以产生无细胞提取物。所有纯化步骤均在277 K下进行。上清液应用于5 ml床体积HiTra镍固定金属离子亲和层析（IMAC）柱（Amersham Biosciences）连接至FPLC系统（Amersham Bioscinces）。用50 m洗脱蛋白质米三氯化氢，150 m米氯化钠，250米米咪唑，pH 8.0。通过SDS–PAGE测定含有蛋白质的组分，将其混合，然后应用于制备的Superdex 200凝胶过滤柱上，在10 m内进行预平衡米MOPS，150米米氯化钠pH值7.0。用与单体相对应的保留体积洗脱蛋白质宏域名。通过SDS-PAGE评估蛋白质的纯度。蛋白质浓缩至8 mg ml⁻¹使用Vivaspin 10 kDa分子量截止离心浓缩器（Vivascience）。蛋白质浓度由280 nm处酶的摩尔消光系数测定（9840米⁻¹ 厘米⁻¹)根据Expasy公司服务器(https://www.expasy.org/tools/portparam.html). 纯化的蛋白质储存在277 K。硒代蛋氨酸（SeMet）标记的蛋白质按照标准程序制备（Doublié，1997)使用与天然蛋白质相同的方法纯化蛋白质，除了1m米将TCEP从IMAC柱洗脱后立即添加到蛋白质中，并添加到凝胶过滤缓冲液中。天然蛋白质和SeMet标记蛋白质的典型产量为每升培养物15–20毫克纯蛋白质。

3.结晶

使用SDS–PAGE检查蛋白质纯度、折叠和单分散性后，圆二色性和动态光散射（祖拉夫和达西，1992年)，SARS-CoV结晶宏在使用帝肯创世纪机器人自动填充的96孔Greiner结晶板中，通过坐滴蒸汽扩散法在292K下筛选域。由于蛋白质含量不是一个限制参数，我们使用以下商业试剂盒采用了宽屏方法：Wizard Screens I和II（翡翠生物结构），Structure ScreensⅠ和II（Jancarik&Kim，1991）; 汉普顿研究院），斯图拉足迹屏幕（斯图拉等。, 1992; 分子尺寸有限公司（Molecular Dimension Limited）和Natrix Screen（Scott）等。, 1995; 汉普顿研究所）。使用8 mg ml⁻¹纯化的蛋白质样品，由一个由AXSYS公司每个水库上方的软件；这些滴剂分别由300、200和100毫升蛋白质溶液和100毫升贮存溶液（苏尔森巴赫等。, 2002). 根据这864种情况，在Stura Footprint Screen中识别出两个点击。使用自制溶液对这些条件进行了初步优化，这些溶液由帝肯Genesis机器人以8×8的格式分配在Greiner结晶板的64孔中。然后将最佳条件转移到24孔组织培养Limbro平板中的悬挂液中。与Greiner板块一样，成百上千的板状多晶体在一夜之间从一个核化点生长而成。在欠饱和平衡液滴中进行微进给，得到适合X射线分析的单晶（图1). 结晶的最终条件如下：2µl蛋白质溶液（8 mg ml⁻¹)与含有0.1米咪唑pH 7.9，1.3米柠檬酸钠。一夜之间，多晶体生长。将其压碎并用于对由2µl蛋白质溶液（8 mg ml）制成的预平衡液滴进行微喂⁻¹)与1µl含有0.1的储液罐溶液混合米咪唑pH 7.8、0.9米柠檬酸钠。这些情况与Saikatendu及其同事发现的情况不同（见表1)，这并不奇怪，因为构建体非常不同（考虑到N-末端标签，Saikatendu及其同事的构建体在N-末端长3个氨基酸，在C-末端长10个氨基酸）。

表1 实验程序和结果的比较   赛卡通杜等。(2005) 当前工作 应变 多伦多2号分离物，gi:34555776 法兰克福1号隔离区，gi:31581502 构造 184–365个nsp3 182–355个nsp3 氨基酸数量 182 174 N端子标签 MGSDKIHHHHH公司 MHHHHH（MHHHH） 蛋白质缓冲液 25米米Tris pH值7.8，150 m米氯化钠 10米米MOPS pH值7.0，150 m米氯化钠 结晶条件 1.85 米丙二酸钠pH 7.0 0.1 米咪唑pH 7.9，1.3米柠檬酸钠 “空间”组 P（P）212121 P（P）21 单位-细胞参数（Ω，°） 一= 76.9,b条= 81.2,c（c）= 125.7 一= 37.4,b条= 55.4,c（c）= 108.9,β= 91.6 衍射极限（Ω） 1.4 1.8 溶剂含量（%） 51 38.9

图1 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的晶体宏域。

4.数据收集和处理

天然晶体和SeMet晶体均在含有储液溶液的溶液中进行冷冻保护，其中添加了20%的甘油，并在液氮中闪速冷冻之前收集到人造纤维环中。所有数据都是使用ADSC Quantum 210电荷耦合器件探测器在法国格勒诺布尔欧洲同步辐射设施的束线ID29处从100K下的单晶中收集的。使用处理数据MOSFLM公司（莱斯利，1992年)并使用标量来自的程序中央对手方清算所4套（协作计算项目，第4期，1994年). 晶体属于空间组 P（P）2₁，带有单位-细胞参数一 = 37.5,b条= 55.6,c（c）= 108.9 Å,β= 91.4 °. 数据收集统计如表2所示. The非对称单元可以包含三种单体中的任何一种V（V）_米价值（马修斯，1968)2.0º^三 Da公司⁻¹和38.9%的溶剂，或两种单体V（V）_米值3.0º^三 Da公司⁻¹和59.3%的溶剂。自转函数并没有解决这种模糊性，因为没有对应于二倍或三倍的显著峰值非晶体学对称性观察到。本地人帕特森地图也没有发现任何峰值。试图通过以下方式解决结构问题分子置换使用基于坐标的各种模型宏域来自富尔吉古珠藻（艾伦等。, 2003; PDB代码1小时)与SARS-CoV共享29%的身份宏域和使用各种程序[AMoRe公司（纳瓦扎，1994年),MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，1997年)和相位器（麦考伊等。, 2005)]事实证明是不成功的。使用从SeMet晶体收集的SAD数据集，我们确定了所有硒原子的位置和结构精炼正在进行中。

表2 数据收集统计 括号中的值表示最高分辨率外壳。   本机数据 SeMet数据 X射线源 欧洲战略参考框架ID29 欧洲战略参考框架ID29 波长（Ω） 0.9792 0.9792 晶体参数      “空间”组 P（P）21 P（P）21  单位-细胞参数       一(Å) 37.4 37.5   b条(Å) 55.4 55.6   c（c）(Å) 108.8 108.9   β(°) 91.6 91.4  分辨率范围（Ω） 40–1.8 (1.9–1.8) 28–1.8 (1.9–1.8) 数据处理      观察到的反射 238756 432355  独特的反射 41448 41654  R（右）合并(%)† 7.7 (18.2) 10.9 (38.6)  完整性（%） 99.6 (98.7) 99.9 (99.9)  多重性 4.8 (5.6) 10.4 (8.9)  平均值我/σ(我) 16.2 (7.9) 17.7 (7.1) †R（右）合并=.

如前所述，Saikatendu及其同事观察到的分子堆积既不允许共结晶实验，也不允许吸食配体实验，因为这两种分子的活性部位都被二聚体界面堵塞了。本研究中获得的不同晶型可能使配体浸泡实验更加成功。