2.1. 主机细胞系生成

通过敲除编码甘露糖的MGAT1基因，从中国仓鼠卵巢（CHO）K1细胞中获得MGAT1敲除（KO）细胞系(α-1,3-）-糖蛋白β-1,2-N个-乙酰氨基葡萄糖转移酶。以MGAT1编码区为靶点的锌指核酸酶对被设计用于识别以下区域的基因：GCCTGCGACCCCCACCaggtGACCCCACTCGGTC。采用标准方案，通过核感染将ZFN质粒转染到宿主细胞。用植物血凝素（PHA）处理MGAT1 KO细胞两代，使其富集。PHA耐药细胞荧光染色白花加兰图斯凝集素（GNA）-FITC检测细胞表面蛋白的高甘露糖糖基化。然后用FACS将强染色细胞亚克隆到96个板中。从单个孔中分离基因组DNA，使用ZFN切割位点侧翼的引物扩增，变性，再退火，并进行CEL1核酸酶测定。CEL1选择性地切割两股之间不匹配的再退火产品。消化产物在琼脂糖凝胶上运行，产生错配的扩增产物通过DNA测序进一步分析。经鉴定，克隆CATSMGATKO-D4在两个等位基因的ZFN切割位点附近都含有移码突变。在该细胞系中表达的重组蛋白显示出同质的人₅糖基化谱（Shi等。, 2004).

2.2. Fc公司γRI生产和净化

人类Fc的DNA编码残基1–277γRI ECD被合成（美国纽约州格兰德岛生命科技公司），并在人巨细胞病毒（CMV）启动子。简言之，使用标准方案通过核感染转染CATSMGATKO-D4细胞，并使用蛋氨酸磺胺（MSX；Sigma–Aldrich，St Louis，Missouri，USA）选择池。然后用流式细胞术评估细胞池中抗人Fc的细胞内染色γRI APC（生命技术）。最佳表达池被扩大并用于生产分泌型Fcγ意大利。

细胞生长13天，之后Fcγ收集含RI的培养基，并通过人IgG Sepharose柱（GE Healthcare，Piscataway，New Jersey，USA），之前用pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水（PBS）平衡。用相同的缓冲液Fc冲洗至基线γRI用皮尔斯洗脱缓冲液洗脱（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科学公司）。含有Fc的分数γRI被合并并加载到5 ml HiTrap SP HP柱上（GE Healthcare），之前用50 m平衡M（M）乙酸钠pH 5.2。用相同的缓冲液Fc洗涤至基线后γRI在0–0.5中洗脱M（M）NaCl梯度。Fc公司γ然后对RI进行25 m透析M（M）Tris–HCl pH 7.5，100米M（M）NaCl在4°C下过夜并浓缩至～4 mg ml⁻¹使用Vivaspin超滤装置（10 kDa截止，美国纽约州波西米亚Sartorius AG）。

2.3. Fc生产和净化

编码跨越221-446个残基的人类IgG1 Fc片段的DNA（欧盟编号公约；Kabat等。, 1991)被克隆到哺乳动物表达载体中人巨细胞病毒（CMV）启动子（Oganesyan等。, 2008)并使用Lipofectamine（Life Technologies）和标准方案瞬时转染到人类胚胎肾（HEK）293细胞。根据制造商的说明，使用HiTrap蛋白a柱进行纯化（GE Healthcare）。在25 m内隔夜透析后M（M）Tris–HCl pH 7.5，4°C，蛋白质溶液进一步应用于HiTrap Q HP 5 ml柱上（GE Healthcare）。使用相同的缓冲液清洗至基线后，Fc在0–0.5中洗脱M（M）NaCl梯度。然后将蛋白质浓缩至～10 mg ml⁻¹使用Vivaspin超滤装置（10 kDa截止，Sartorius AG）。相应的SDS-PAGE图谱仅显示在还原或非还原条件下分别存在25或50 kDa左右的一条谱带（数据未显示）。

2.4. 复合物的形成和结晶

先前纯化的FcγRI和Fc以1:1摩尔比混合。使用Superdex S200 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）对复合物进行进一步纯化。然后将纯化的复合物浓缩至约5.5 mg ml⁻¹使用Vivaspin浓缩器（30 kDa截止，Sartorius AG）并进行结晶试验。坐滴结晶实验最初是使用Phoenix结晶机器人（Art Robbins Instruments）和汉普顿研究与分子尺寸公司（Hampton Research and Molecular Dimensions）的商用屏幕在96 well Intelli-Plates（美国加利福尼亚州森尼维尔市Art Rob宾斯仪器公司）进行的。使用24孔Linbro板，使用不同滴体积和滴中蛋白质与储液溶液的比例（通常为1-6µl和1:1-5:1），以悬挂滴的形式进行结晶优化(v（v）:v（v）)分别是。衍射质量的晶体是从50 m的储层溶液中生长出来的M（M）脱水乙酸锌，20%PEG 3350。为了冷冻保护，将晶体转移到补充有25%甘油的相同溶液中，并在液氮中闪蒸冷却。

2.5. X射线数据采集和结构测定

在配备PILATUS 6M探测器（Dectris）的美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学阿贡国家实验室（Argonne National Laboratory）先进光子源（APS）的IMCA-CAT 17-ID光束线上，从单晶上收集衍射数据集。在APS上使用0.5°的振荡范围、401 mm的晶体-探测器距离、1s的曝光时间和1.0000 Au的波长记录360个衍射图像。衍射数据使用XDS公司一揽子计划（Kabsch，2010年).

2.6. Fc的生成γRI变体

Fc公司γRI:转发γRIIIA嵌合体使用以下域边界设计：FcγRIIIA（D1），19-106；Fc公司γRIIIA（D2），107–208；Fc公司γRI（D1），21–102；Fc公司γRI（D2），103–187；Fc公司γRI（D3），188-282。Fc公司γRI及其变异体被克隆到基于Orip/EBNA-1的上位哺乳动物表达质粒pOE（Dimasi等。, 2009). 使用标准方案，在无血清培养基中瞬时转染CHO细胞产生蛋白质。转染后10天收集细胞培养上清液，并通过0.22µm无菌过滤器（美国纽约州华盛顿港PALL生命科学公司）。变异体通过亲和层析使用IgG Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare）并将缓冲液交换为PBS pH 7.2。Fc公司γRIIIA由Dall’Acqua生产等。(2006). 纯化蛋白的浓度根据其在280 nm处的吸光度测定。

2.7. Fc的绑定γIgG1的RI变异体

ELISA板涂有FcγRI、FcγRIIIA，个人Fcγ2µg ml的RI变体或对照gp130⁻¹在4°C、pH 7.2的PBS中20小时，然后用3%封闭(v（v）/v（v）)含0.1%脱脂奶(v（v）/v（v）)在室温（RT）下，在pH 7.2的PBS中加入吐温20，持续1小时。浓度为10、5或2.5µg ml的人IgG1（R347）⁻¹然后将pH 7.2的PBS加入孔中，并在RT下孵育1小时。将HRP缀合的驴F（ab′）2片段抗人IgG（h+L）（Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania，USA）用作第二抗体，在RT下孵育45分钟，并使用四甲基联苯胺（TMB；Dako，Carpintia，California，USA）显影平板。信号被1猝灭M（M）H（H）₂SO公司₄并使用EnVision平板读取器在450 nm下读取（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市珀金埃尔默）。

3.1. Fc的结构γRI–Fc复合物

我们对Fc之间形成的络合物进行了晶体学研究γRI ECD和人类IgG1的Fc部分试图解释相应相互作用的高亲和力。这两种蛋白都在哺乳动物细胞中表达，经过纯化、复合和结晶。晶体有C类2对称，具有晶胞参数一= 134.7,b条= 126.8,c（c）= 71.8 Å,β=118.4°，衍射至2.4°分辨率。结构由以下因素决定分子置换使用MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年). Fc的搜索模型γRI由PDB条目组成3rjd公司（卢等。, 2011). Fc的搜索模型由另一个Fc部分组成，其氨基酸序列与本研究中的相同，在与上述相同的条件下表达和纯化（参见§2） 其结构已在高分辨率下测定（1.5º；未发布的数据）。搜索模型中不包括碳水化合物部分。一个Fc（两个相同的多肽）和一个FcγRI分子位于单位电池（图1一). 使用REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)和O（运行）（琼斯等。, 1991). 复合体两个成员的整体褶皱与相应模板的褶皱相似。其中一个Fc的残留物232–446的电子密度多肽（链E）和氨基酸236–444的其他（链J）。因此，模型中不包括E链N末端的11个氨基酸和J链N末端的15个氨基酸，以及J链C末端的445和446个氨基酸。八个N端子和十个C端子FcγRI残基以及对应于位置44-54、87-90和219-222的氨基酸没有可追踪的电子密度。这两种蛋白质都有许多N-连接的碳水化合物链（补充图S1）。附着在Fc Asn297上的那些在电子密度上直到最后都很明显N个-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）。Fc周围的电子密度γRI Asn59、Asn78、Asn152、Asn159和Asn163占GlcNAc₂/男人₁，GlcNAc公司₁，GlcNAc公司₁，GlcNAc₁/男人₁和GlcNAc₂分别是。其中一些碳水化合物，即Asn78附近的GlcNAc和Asn159附近的Man，其电子密度远低于其他电子密度，可能是由于糖部分的构象异质性（补充图S1）。最终精制模型包含5311个蛋白质原子、321个碳水化合物原子、三个锌离子（存在于结晶溶液中）和156个溶剂分子。数据和细化统计如表1所示.

表1 X射线数据和模型修正统计 括号中的值表示最高分辨率外壳。 数据统计  波长（Ω） 1  分辨率（Å） 86.6–2.4 (2.43–2.42)  “空间”组 C类2  单位-细胞参数（Ω，°） 一= 134.7,b条= 126.8,c（c）= 71.8,β= 118.4  总反射 134782 (1507)  独特的反射 39992 (426)  完整性（%） 98.7 (100.0)  R（右）合并 0.062 (0.476)  平均值我/σ(我) 14.4 (2.4)  多重性 3.4 (3.5)  科科斯群岛1/2 0.995 (0.856) 精炼统计  分辨率（Ω） 86.6–2.4  R（右）工作 0.201  R（右）自由的 0.254  R（右）工作+免费 0.203  R.m.s.d.，键（Å） 0.011  R.m.s.d.，角度（°） 1.566  拉马钱德兰阴谋†   最惠地区残留量（%） 93.6   附加允许区域内的残留物（%） 6.4   大面积允许区域内的残留量（%） 0  蛋白质原子数 5311  非蛋白质原子数 480  平均值B类因子（模型/Wilson）（λ2) 34.2/43.5 †Ramachandran地块使用PROCHECK检查（拉斯科夫斯基等。, 1993).

图1 人IgG1 Fc与人Fc ECD形成复合物的概述γ意大利。(一)Fc–FcγRI（鲑鱼/绿色）复合体显示为缎带和碳水化合物作为棍子。Fc公司γRI D2似乎是与Fc接口的唯一结构因素。(b条)Fc–Fc的表面表示γRI复合体，其中FcγRI（绿色）已从Fc（橙色）移开20度，以显示形状互补性。此图和其他图是使用PyMOL公司（薛定谔）。

Fc和Fc之间的接口γRI覆盖~1160°²涉及Fc的两条链。Fc和Fc之间无碳水化合物-碳水化合物或蛋白质-碳水化合物相互作用γ观察RI。Fc和Fc之间的形状互补性γRI非常高（图1b条). 使用以下公式估算为0.82S公司_c（c）（Fc链J为0.78，Fc链E为0.84；Lawrence&Colman，1993年)，高于抗体重链和轻链之间的互补性（即0.69）。电荷互补性也很显著（图2一和2b条). 正电荷Fcγ发现RI贴片朝向带负电荷的Fc口袋。Fc公司γRI D2被发现是与Fc相互作用的唯一原因，因为在距离截止至5°的范围内没有发现涉及D1和D3的接触。

图2 Fc和Fc之间的电荷互补性γ意大利。正负静电势分别用蓝色和红色表示，并使用APBS公司(自适应泊松-Boltzmann解算器; 贝克等。, 2001)插件PyMOL公司.Fc上带正电荷的表面γRI公司(一)与带负电荷的Fc贴片对齐(b条).

Fc之间的接口γRI和两条Fc链（E和J）并不同等重要。特别是Fc之间的接口γRI和Fc链E构成了一个主要的相互作用区域。络合物形成显著性得分国际学生成绩评估（Krissinel&Henrick，2007）)是显著的0.963，仅略低于两个Fc之间的值多肽(1.000). Fc之间形成六个氢键γRI D2和Fc区跨越残基233-ELLGGPS-239（图3一，补充表S1）。此外，还有一个非常突出的“锁和钥匙”功能。对应于Leu235（EL）的“键”L（左）G） ，位于Fc内γRI口袋呈现正电荷“边缘”（图3b条). 口袋由Fc中的疏水性氨基酸Leu105、Trp106、Ala126、Trp127和Val132组成γ意大利。此外，在Fc中，Lys173和Leu131的主链N和O原子之间形成的氢键加强了这些疏水相互作用γ带有Fc L235主链O和N原子的RI（图3一). 另一个Fc链（J）仅与Fc建立了三个氢键γRI D2（图3c（c），补充表S1）。

图3 (一)Fc（E链，鲑鱼；0.963的显著性）和Fc之间分子间接触的表示γRI D2（绿色）。(b条)Fc公司γRI创建了一个口袋（“lock”），将Leu235放入Fc-E链（“key”；鲑鱼）。(c（c）)Fc（J链，鲑鱼；重要性为0.348）和Fc之间分子间接触的表示γRI D2（绿色）。Fc残留物根据欧盟编号公约（Kabat等。, 1991). 虚线表示氢键（距离以Ω表示）。这些界面都不涉及碳水化合物。

3.2. Fc的比较γRI–Fc X射线结构

在我们准备手稿的时候，人类Fc的两个X射线晶体结构γRI与IgG1 Fc复合，分辨率分别为3.5和1.8Ω（Lu等。, 2015; 清崎（Kiyoshi）等。, 2015). 这三种结构在域组织和所有结构的相对位置方面大体相似多肽。因此，Fcγ清崎描述的RI突变等。(2015)不影响其结构或与Fc的交互模式。这些结构叠加了2.2°（Lu）的r.m.s偏差等。, 2015)和0.34º（清朝等。, 2015)C以上^α原子。我们还注意到，这里描述的晶体形式与清崎提出的几乎相同等。(2015)根据判断空间组和单位-细胞参数。卢等。(2015)建议Fc之间的相互作用γRI Arg175和Fc碳水化合物可以解释相应的高亲和力。事实上碳水化合物Fc Asn297（单位：Fc）γR绑定已建立。人们相信聚糖允许Fc C_H（H）2个结构域保持受体结合的良好距离和构象（Radaev等。, 2001; Jefferis&Lund，2002年; 阿诺德等。, 2007; 费热等。, 2009). IgG1的逐渐缩短碳水化合物也会导致Fc的相应亲和力逐渐减弱γR（三村等。, 2000). 对这种具有截断碳水化合物链的Fc的结构研究表明，总C缩短_H（H）2–C_H（H）2距离（克拉普等。, 2003). 然而，由于卢出版的结构分辨率有限等。(2015)，我们发现聚糖没有准确建模，并且显示出禁用的糖构象。我们目前的结构没有显示任何与聚糖相关的相互作用，这加强了先前的发现，即糖对复合物的形成不是严格要求的（萨津斯基等。, 2008)或参与重要的分子间相互作用等。, 2015). 特别是，复合物中伴侣分子之间的最近距离涉及到人类₁附着在Fc上的残留物γRI Asn58和Fc链E Ala330，估计约为12º。

此外，我们的结构表明Fc Leu235起主要作用（图3b条)与清桥达成一致等。(2015)和Lu等。(2015). 我们的结果也与查佩尔的结果非常一致等。(1991)，通过将234-LGG-237基序引入人类IgG2并恢复与Fc的高亲和力结合，证明了该区域的主要参与γ意大利。

3.3. Fc的结构比较γ自由态和束缚态的RI

哺乳动物细胞衍生Fc整个ECD的X射线结构γLu之前以2.65º的分辨率确定了未公开状态下的RI等。(2011). 三个Fcγ我们结构的RI子域和这个未链接的FcγRI表现出相似但不相同的构象和畴间相互作用。当使用全长ECD时，相对于C的r.m.s偏差^α原子数为1.8℃。当在域水平进行叠加时，偏差要小得多，D1、D2和D3的估计偏差分别为0.38、0.37和0.56º。然后，我们对未连接和绑定Fc进行了结构叠加γRI至FcγRI D2是与Fc相互作用的主要贡献者，其目的是检测Fc结合后相对域方向的任何变化（图4). 特别是，D1和D2之间的锐角，Lu之前对此进行了详细描述等。(2011)，保持不变。我们还发现FcγRI D3是最不对齐的。由于它不与D1或D2或Fc接触，其位置很可能由晶体接触和Fc之间连接肽的灵活性决定γRI D2和D3。补充表S2显示了域间相互作用的微小差异。

图4 免费（PDB条目的叠加3rjd公司; 品红）和装订（本研究；绿色）FcγRI使用D2 Cα原子。Fc结合后未见明显构象变化。然而，Fc的位置γRI D3，不参与与Fc、Fc的任何相互作用γRI D1或FcγRI D2似乎取决于晶体堆积和/或连接结构域2和3的肽的灵活性。所有叠加均使用LSQKAB公司（卡布施，1976年).

3.4. Fc的相对功能重要性γRI域

我们的结构分析表明FcγRI D2是Fc绑定的唯一贡献者。调查FcγRI域I和III发挥任何功能作用，我们生成了几个变体，其中Fc的各个域γRIIIA（F158）和FcγRI被交换（图5一). 然后通过ELISA分析人类IgG1与这些变体的结合（图5b条). 在没有D3（V4）的情况下，Fc的结合γ与整个Fc相比，RI至IgG1仅略弱γRI ECD，提示D3可能有一些次要的间接作用。Fc的IgG1结合轻微增加支持了这一点γ含有Fc的RIIIAγ与Fc相比，RI D3（V3）γ瑞拉。缺失变量（V1）或包含变量（V4）FcγRI D1与IgG1的结合几乎相同。这表明D1在Fc之间是可互换的γRI和FcγRIIIA并没有特别促进IgG1结合。重要的是，我们的结果突出了Fc的重要性γRI D2，因为所有缺乏该结构域的结构体（V2和V3）与IgG1的结合都严重受损。同样，V1构造，其中D2构成唯一的FcγRI组分几乎与整个Fc一样与IgG1结合γRI ECD。综合起来，我们的数据显示FcγRI D2是赋予Fc高亲和力结合的最重要的结构域。这与之前使用小鼠分子的数据非常一致（Hulett&Hogarth，1998).

图5 (一)人类Fc结构域排列示意图γRI、FcγRIIIA及其变体。绿色和蓝色椭圆对应于FcγRI和FcγRIIIA域。低亲和力FcγRIIIA/F158同种异型用于表征变体时获得更大的亲和力范围。(b条)不同浓度的人IgG1与Fc的结合γ通过ELISA测定的R变异体。标准偏差用误差条表示，代表同一实验中的三次重复测量。