2.1. 基于图书馆的构建筛选

编码FCoV nsp4的序列（来自菌株FIPV WSU-79/1146的多聚蛋白pp1a的2337–2826残基；Genebank/RefSeq登录号NC_007025.1）是从病毒RNA中扩增的RT-PCR，并克隆到pMM8载体中。pMM8是一种改良的pET-43（Novagen）细菌表达载体，含有限制性位点，适用于基于核酸外切酶的结构-菌体生成（Cornvik等。, 2006)以及插入His-tag编码序列下游的用于重组克隆的网关盒。使用核酸外切酶策略生成N-末端缺失的构建体文库，并使用集落过滤印迹筛选可溶性构建体（Cornvik等。, 2005, 2006). 选择含有2731–2826残基（此处称为nsp4ct结构域）的可溶性且表达良好的构建物进行大规模表达和纯化。这个结构有14个额外的N末端残基，包括一个不可分裂的His₆标签。

2.2. 表达式

可溶性nsp4ct的表达在大肠杆菌菌株BL21（DE3）（Novagen）。培养物在含有50µg ml的LB培养基中在310 K下生长⁻¹氨苄西林直到OD₆₀₀达到0.8。蛋白质合成是通过添加1mM（M）异丙基β-天-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），培养物生长至固定相288 K下过夜。4000 K下离心收集细胞克（30分钟，277 K）并在253 K冷冻。硒代蛋氨酸取代的nsp4ct在非蛋氨酸营养缺陷型中表达大肠杆菌菌株BL21（DE3）（Novagen）。细菌在310 K的最小培养基中生长，直到OD₆₀₀达到0.8。添加反馈抑制氨基酸混合物（Lys、Thr、Phe、Leu、Ile、Val和SeMet），15分钟后用1 mM（M）IPTG。将培养物在288 K下摇晃过夜，然后在4000 K下离心收集细胞克（30分钟，277 K）。细胞颗粒在253 K下冷冻。

2.3. 净化

天然和SeMet取代的nsp4ct蛋白按照相同的方案进行纯化。将来自1 l细胞培养物的颗粒重新悬浮在20 ml缓冲液中A类（10米M（M）CHES pH 9.1和300 mM（M）氯化钠，加上2 mM（M） β-SeMet替代nsp4ct的巯基乙醇）。对细胞进行声波处理，并通过Ni–NTA从可溶性细胞组分中纯化蛋白质亲和层析用缓冲液洗脱A类含500mM（M）咪唑。这个洗脱液已将缓冲区交换为缓冲区A类使用PD10列（GE Healthcare Life Sciences）。随后将nsp4ct浓缩并应用于Superdex 75（16/60）凝胶过滤柱（GE Healthcare Life Sciences）上，使用缓冲液进行预平衡A类.将蛋白质浓缩至10 mg ml⁻¹用SDS-PAGE检测其纯度。

2.4. 结晶

在汉堡EMBL高通量结晶设施（Mueller-Dieckmann，2006）中，在292 K的96个well板（Greiner）中使用坐滴蒸汽扩散法进行了初始结晶试验). 在各种条件下获得了晶体。在292 K条件下，使用悬挂滴蒸气扩散法在24孔板（Qiagen）中手动对这些条件进行进一步优化。在蛋白质浓度为7 mg ml时获得晶体⁻¹0.22英寸M（M）硫酸铵和25%(w个/v（v）)聚乙二醇5000。

2.5. 数据收集和处理

晶体在0.22的溶液中进行冷冻保护M（M）25%硫酸铵(w个/v（v）)聚乙二醇5000和15%(v（v）/v（v）)在数据收集之前使用乙二醇。收集了三个数据集：两个单波长本地数据集（数据集1和2）和一个单波长异常衍射（SAD）数据集（峰值波长；数据集3）。数据集1是使用MAR 225 CCD探测器从欧洲同步辐射设施（ESRF）光束线ID23-2上100K的单晶中收集的。振荡范围为1°，晶体到探测器的距离为346.2 mm。采集了90张图像，最大分辨率为3.1º。数据集2是使用MAR 225探测器从DESY的EMBL光束线X12上100K的单晶中收集的。晶体到探测器的距离为300 mm，振荡范围为0.25°。共收集了670张图像，最大分辨率为2.76欧。数据集3也从光束线X12（汉堡EMBL）上的单晶中收集。晶体到探测器的距离为280 mm，振荡范围为1°。200张照片吸收边缘收集到的最大分辨率为3.3º。

在所有三种情况下，记录的图像都用XDS公司（卡布施，1988年)反射强度用战斗和缩放比例SCALA公司（埃文斯，1993年)来自中央对手方清算所4程序集（协作计算项目，1994年第4期). 数据收集统计如表1所示.

2.6. 结构确定

该结构是使用汽车里克肖自动晶体结构测定平台（Panjikar等。, 2005).F类_A类使用程序计算值SHELXC公司（谢尔德里克，2008年). 根据对数据的初步分析下部结构测定和初始相计算设置为3.8º。使用该程序发现了20个硒位置搁架（谢尔德里克，2008年). 正确的手下部结构已使用程序确定防抱死制动系统（郝，2004)和SHELXE公司（谢尔德里克，2008年). 所有下部结构使用该程序对原子进行了优化英国石油公司3（潘努等。, 2003; Pannu&Read，2004年). 通过密度调整改善了初始阶段，非晶体对称性使用程序进行（NCS）平均和相位扩展RESOLVE（解决）（特威利格，2000年). A部分α-使用该程序生成螺旋模型螺旋形的（莫里斯等。, 2004). 部分模型包含四个分子的440个残基中的119个。通过使用该程序将实验阶段和模型阶段相结合，改进了初始阶段SIGMAA公司（里德，1986年). 如上所述，再次重复密度修改和四倍NCS平均。生成的阶段用于继续使用程序进行模型构建ARP协议/弯曲（佩拉基斯等。, 1999)从而放置了242个残留物。在以下中间步骤中生成的部分模型ARP协议/弯曲然后使用图形程序组装几乎完整的二聚体库特（埃姆斯利和考坦，2004年). 然后使用该二聚体，使用相控分子置换技术在电子密度中找到第二个二聚体MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，1997年). 2F类_o个−F类_c（c）和F类_o个−F类_c（c）在此阶段计算的电子密度图显示了额外的电子密度，表明在非对称单元。分阶段分子置换再次重复以将第五个分子放置在电子密度图中。然后将合成模型用于约束细化在里面REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 1997)，包括使用平移、平动和螺旋法（TLS；Schomaker&Trueblood，1968)用于描述组运动。

手动修改结构，然后循环精细化，使用程序库特.项目进展精炼被免费监控R（右）因子（Brünger，1992). 在2个F类_o个−F类_c（c）和F类_o个−F类_c（c）地图和合适的氢键可以与周围的残留物或其他水分子结合。该程序对模型的立体化学进行了评估防霉剂（戴维斯等。, 2007).

分子之间的界面用国际学生成绩评估服务器（Krissinel&Henrick，2007）). 分子之间的相互作用最初使用中央对手方清算所4程序联系人最大接触距离为3.6Å。

3.1. 结构确定

重组His₆-标记的FCoV nsp4ct结构域（pp1a的残基2731–2826和nsp4的残基395–490；此处重新编号为1–96）在大肠杆菌该蛋白也通过蛋氨酸被硒蛋氨酸（SeMet）取代来表达。基质辅助激光验证了SeMet的掺入解吸电离（MALDI）质谱法。天然和SeMet取代的蛋白质都是在含有硫酸铵和PEG 5000的条件下结晶的。这些晶体属于空间组 P（P）4_三，带有单位-细胞参数一=b条= 127.5,c（c）=42.8º（表1中的数据集2). 有五个分子（链A类–E类)在非对称单元，相当于64%的溶剂含量（Matthews，1968). 该结构以2.8º的分辨率细化至最终R（右）24.0%的值(R（右）_自由的= 29.9%). 最终模型包含分子中的96个残基A类（残基0-95），分子中93个残基B类（残基0-49和53-95），分子中92个残基C类（残基0-91），分子中91个残基天分子中的（残基1–91）和84个残基E类（残基0-49和56-89）。88.0%的残留物位于Ramachandran图的首选区域，10.9%位于允许区域。残留物Met55（链A类和B类)，Glu57（链条C类和天)和Ala58（链条A类–E类)是Ramachandran的异常值。Glu57和Ala58位于螺旋的N端α3.该区域的几何形状可能受到Glu57O之间氢键的影响^∊和Arg61 N^η精制结构包含两个硫酸根离子和40个溶剂分子。表1中给出了数据收集和结构重新定义统计的详细摘要和2.

3.2. 总体结构

FCoV nsp4ct结构包含六个短β-股β1–­β6和4α-螺旋线α1–α4（图1). 股β1和β2股和股β3和β5形成小的两个品牌的反平行片。股β4和β6参与二聚体界面的形成。搁浅β分子中观察到4C类和天和钢绞线β分子中观察到6A类–天该结构的特征是21个剩余长度的螺旋α4.使用EBI网络工具进行分析（PDBsum/ProFunc、Catalystal站点搜索；https://www.ebi.ac.uk网站),DALI公司(https://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali服务器/)和GRATH公司(https://protein.hbu.cn/cath/cathwww.biochem.ucl.ac.uk/cgi-bin/cath/Grath.html)对于单体和二聚体来说，没有任何显著的功能指标或结构相似性。因此，该结构代表了一种新的蛋白质折叠。Nsp4ct有九个保守的和两个非保守的疏水残基（图2)形成结构的疏水核心。这些残基分为一个主要的脂肪族（Phe19、Ile21、Leu29、Ile38、Leu68、Leu72）和两个芳香族（Phe 11、Tyr41、Tyr 65和Tyr26，Tyr75）（图3).

图1 nsp4ct结构域的整体结构（分子A类如图所示）。α-螺旋以紫色显示，β-线束以黄色显示，线圈和末端以浅蓝色显示，区域形成β-仅存在于二聚体界面的链用红色表示。

图2 nsp4ct蛋白氨基酸序列的比对，以及FCoV nsp4ct三维结构的二级结构信息。该比对基于猫传染性腹膜炎病毒（FCoV，NC_007025.1）、人冠状病毒NL63（HCoV，ABE97129）、小鼠肝炎病毒（MHV，NP_001012459.1）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS_CoV，NP_904322.1）和传染性支气管炎病毒株Beaudette（IBV，NP_ 740625）的氨基酸数据。路线是用ClustalW公司2（拉金等。, 2007)并使用编辑JalView公司.残留物根据保存情况从完全保存（深蓝色）到非保存（无色）进行着色。

图3 FCoV nsp4ct的带状视图显示了疏水残基的侧链，这些疏水残基对蛋白质折叠很重要，被描绘成范德瓦尔斯球体。残基分为三组，即主要脂肪族（Phe19、Ile21、Leu29、Ile38、Leu68和Leu72，黄色）、芳香族1（Phe11、Tyr41和Tyr65，红色）和芳香族2（Tyr26和Tyr75，绿色）。

C之间的r.m.s.d^α分子的原子A类–E类小于0.1º（对于63个普通C^α原子）。分子之间的差异存在于N末端（残基0-4）、C末端（从残基88开始）和残基46和64之间的区域，包括螺旋的C末端部分α3、柔性回路L_α3–α4和螺旋线的N端α4

3.3. Dimer接口

FCoV nsp4ct晶体在非对称单元。分子A类/C类和B类/天形成非常相似的二聚体（图4一)，每个尺寸约为60×20×20°。每个分子的平均埋表面积约为961²每个二聚体的埋藏表面包含大约25个来自α1,α三，α4，回路L_α3–α4和C终点。有趣的是，相互作用界面包含一个分子内三链反平行β-第页。此表中的股的顺序为β4_C类-β6_A类-β6_C类在二聚体的情况下A类/C类和β4_天-β6_B类-β6_天在二聚体的情况下B类/天.绞线β4_C类和β4_天包括残留物51–53，股β6_A类和β6_B类包括残余物89–92和股β6_C类和β6_天包括残基88–90。此界面上的主要交互是β-片状氢键Val89 N­Gly53 O、Val89 O­Gly 53 N、Ser90 N­Ser90 O、Ser90 O­Ser90N、Val91 N­Tyr51 O、Asn92 N­Tir88 O和Asn92 O­Try88 N。五个氢键位于β-形成片状区域：Met55 O­Tyr60 O^η、Tyr60 O^η·Met55 O，Tyr60 O^η●Met55 N，Thr94 O^γ·Thr85 O和Thr94 O^γ·通过85 O^γ（图4b条). 二聚体埋藏区残留物之间的强范德华接触对确定界面也很重要。

图4 (一)分子间的二聚体界面A类和C类以立体对的形式在动画中显示。分子A类以绿色和分子显示C类以黄色显示。单体在界面处的表面以网格表示形式显示。(b条)二聚体界面上的氢键Val89 N？Gly53 O、Val89 O？Gly53N、Ser90 N？Ser90 O、Ser90 O？Ser90 N、Val91 N？Tyr51 O、Asn92 N？Try88 O、Asn 92 O？Tyr 88 N、Met55 O？Try60 Oη、Tyr60 Oη·Met55 O，Tyr60 Oη●Met55 N，Thr94 Oγ·Thr85 O和Thr94 Oγ·通过85 Oγ显示为虚线。分子A类以绿色显示，分子C类以黄色显示，O原子以红色显示，N原子以蓝色显示。为了清楚起见，形成二聚体界面的链的箭头（卡通表示）未显示在该面板中。

分析得出的结果尺寸排除色谱法nsp4ct证明，在所用的实验条件下，该蛋白在溶液中是单体的（结果未显示）。此外晶体结构包含一个单体和两个二聚体。埋藏表面积支持二聚体的可能性，这可能具有生理意义。可以想象体内在膜修饰或RTC形成过程中，nsp4二聚体可能有助于将组分聚集在一起，从而有助于其正确的空间定向。这将与之前提出的nsp4作为病毒RTC组装锚定的作用相一致。

3.4. Nsp4ct序列比对

图2显示序列比对，使用ClustalW公司2（拉金等。, 2007)五个冠状病毒亚群nsp4的C末端结构域。这些病毒包括FCoV（1a组）、人类冠状病毒NL63（HCoV-NL63；1b组）、小鼠肝炎病毒（MHV；2a组），SARS-CoV（2b组）和传染性支气管炎病毒（IBV；3组）。同一组（但不同亚组）病毒之间的nsp4ct序列同源性高于不同组的病毒。FCoV与HCoV-NL63之间的序列同源性为68%，MHV与SARS-CoV之间的序列一致性为53%。另一方面，IBV是最远距离相关的病毒，在与其他病毒的所有可能组合中，其序列同源性约为35%。这与之前发表的冠状病毒（Gorbalenya）的系统发育分析一致等。, 2004). 序列比对显示nsp4ct结构域高度保守，大约100个残基中的17个在所有五个亚组之间是相同的。冠状病毒nsp4ct的大多数芳香氨基酸高度保守。这包括完全保守的残基Phe19、Tyr41、Tyr 50、Tyl60和Tyr84，以及Phe11（IBV中的Tyr）、Tyry26（IBV里的Phe）、Phe45（其他四种冠状病毒中的Ty）和Tyr 51和Tyr75（MHV和SARS-CoV中的Phe都是）。有趣的是，Phe45、Tyr50、Tyr 51、Tyyr60和Tyr84是FCoV nsp4ct二聚体界面的一部分，而完全保守的Tyr60形成侧链（O^η)第二单体Met55的主链羰基与氢键的相互作用。两个完全保守的C-末端残基（Leu95和Gln96）是识别站点针对冠状病毒M^{赞成的意见}（Hegyi和Ziebuhr，2002年).

有四个高度保守的残基簇。第一个在残基9和19之间，包括螺旋中的残基α1和股β3.第二种包含属于螺旋的残基45–53α3和回路L的一部分_α3–α4有趣的是，FCoV nsp4ct结构的五条独立链在该区域差异最大，表明其具有高度的灵活性。在分子的情况下B类和E类它是无序的，残基50-52和50-55分别没有可见的电子密度。在分子中A类,C类和天这个区域可以被放置在电子密度中，并参与二聚体的形成。该簇的高序列保守性及其结构灵活性表明，它可能在nsp4ct域功能中发挥重要作用。属于螺旋的残留物60–71α4构成第三个高度保守簇，第四个簇由C末端残基81–96组成。最后一个簇包含高度保守的Tyr84、Pro86和Pro87，它们构成Yx个PP基序，与共识PP相反x个由I类WW结构域识别的Y序列（Linn等。, 1997). 迪莱瓦等。(2006)表明I类WW结构域不需要具有一致序列的肽，也可以结合倒置肽序列。唯一的情况是存在多聚脯氨酸II（PPII）成分，这在FCoV nsp4ct病例中观察到。这表明84-87区域是蛋白质-蛋白质相互作用的合理候选区域。PROSITE公司(https://www.expasy.org/prosite网站/)对所有FCoV nsp的分析没有发现任何可能的WW域，这表明Yx个PP基序相互作用的伴侣是宿主蛋白。此外，Pro-Pro基序的定位可以保护扩展的非结构化C末端免受宿主酶（Vanhoof等。, 1995).