1.简介

皂苷是一类重要的糖基化化合物次级代谢产物广泛分布于植物界。三萜皂苷主要存在于双子叶植物中，如豆科植物，但也存在于一些单子叶植物中。甾体皂苷不太常见，主要存在于百合科等单子叶植物中。甾体糖生物碱存在于350多种植物中，主要存在于茄科植物中，茄科植物包括马铃薯和番茄（Hostettmann&Marston，1995）). 许多皂苷具有抗真菌活性，因为它们通常以相对较高的水平存在于健康植物中，可能有助于植物抵抗真菌的攻击（Morrissey&Osbourn，1999). 因此，皂苷可被视为预成型抗菌剂。

有很好的证据表明，皂苷对真菌的毒性主要机制与其膜分解作用有关（在Morrissey&Osbourn，1999年进行了综述). 这是因为它们能够与膜形成复合物甾醇，导致孔隙形成、电解质泄漏和膜完整性损失。一些真菌由于其膜成分而对皂苷具有内在抗性。其他真菌产生特定的皂苷解毒酶。许多植物病原真菌产生胞外酶来解毒皂苷（Morrissey&Osbourn，1999）). 皂苷在植物界的广泛分布表明，对其解毒的能力可能是植物病原真菌的一个共同属性。根侵染病菌产生的皂苷脱毒酶avinacise禾顶囊壳对燕麦根三萜皂苷进行解毒，并已被证明是宿主范围的决定因素（鲍耶等。, 1995).

许多感染西红柿的真菌会产生一种名为tomatinases的酶，对甾体糖生物碱进行解毒α-tomatine（1999年在Morrissey&Osbourn杂志上评论).α-西红柿碱的浓度很高（高达1mM（M）)在番茄的叶子、茎、根和绿色果实中，这表明它可能在抵抗潜在病原体方面很重要。斑枯病番茄叶斑病的病原体，具有一种能解毒的组成型番茄酶α-？通过移除单个端子实现番茄酱D类-葡萄糖部分（Pegg&Woodward，1986年; 奥斯本等。, 1995; 砂岩等。, 1995). 的突变番茄链球菌在茄科植物中，不能产生番茄酶的物质会引发防御反应的增强（马丁·埃尔南德斯等。2000年; 波拉布等。2002年). 有趣的是，这些实验和其他数据表明α-？番茄红素水解能够直接或间接干扰诱导的植物防御反应（Martin-Hernandez等。2000年; 波拉布等。2002年). 皂苷酶（如番茄红素酶）的高底物特异性和胞外性质使其成为设计用于控制植物真菌疾病的抑制剂的诱人靶点。

预测的番茄酶氨基酸序列表明它属于糖基家族3水解酶类（奥斯本等。, 1995; 砂岩等。, 1995). 这个家族有100多个成员，包括真菌和细菌纤维二糖降解酶（Henrissat&Bairoch，1996）). 家庭中唯一的成员晶体结构有大麦吗β-D类-葡聚糖外水解酶（Varghese等。, 1999). 这种结构被用来为代表主要系统发育簇（哈维）的其他家族成员生成比较（同源）模型等。2000年). 建议集群成员（包括番茄蛋白酶）包含(α/β)₈-桶和(α/β)₆-大麦外水解酶结构域1和2的夹心结构（氨基酸序列中的顺序相同）。然而，它们比大麦酶大得多（在番茄蛋白酶中多198个残基），因此具有额外的预测域。此外，番茄蛋白酶的对齐区域与大麦酶只有22%的序列一致性，对于这种高度分化的蛋白质，同源模型不太可能准确描述番茄蛋白酶的结构。

在本文中，我们报道了一种高效纯化番茄红素酶的策略的开发斑枯病培养滤液和蛋白质成功结晶。X射线数据是从天然蛋白质晶体中收集的。确定晶体结构有望为皂苷酶抑制剂的设计提供结构基础。

2.材料和方法

3.结果和讨论

开发了一种简单的三步纯化方案，以最大限度地提高真菌细胞培养基中番茄红素酶的产量（图1). 表1列出了该程序中番茄蛋白酶的产量和比活性与之前公布的方法相比，有了重大改进(例如奥斯本等。, 1995; 砂岩等。, 1995)涉及使用分批阴离子交换蛋白浓缩步骤代替使用硫酸铵作为沉淀剂。最终产量为每升真菌培养基1.0mg蛋白质，纯化因子为15.5。纯化程序浓缩步骤后，番茄灰酶制剂的总活性增加很有趣，这可能是由于去除了干扰番茄灰酶或葡萄糖氧化酶活性或两者都干扰的高分子量因子所致。需要进一步调查以确定该部件。

图1 银染的10-20%梯度SDS-PAGE凝胶显示了tomatinase纯化的进展。车道M（M），分子量标记（kDa）；第1道，培养滤液（总蛋白100ng）；通道2，POROS HQ阴离子交换后的混合馏分色谱法（总蛋白10 ng）；lane 3，纯化番茄蛋白酶（10ng蛋白）

尽管蛋白质有广泛的糖基化作用，但使用纯化酶进行的结晶试验从含有17.5%混合物的结晶溶液中获得了晶体(w个/五)聚乙二醇4K和5%(五/五)2-丙醇作为沉淀剂。结晶条件的优化得到了典型尺寸为100×50×20µm的单晶。当用SDS-PAGE分析溶解晶体中的蛋白质时，染色时检测到一条表观分子量为110kDa的单一条带。这些样本也对α-番茄红基质。

晶体被冷冻保护20%(w个/五)聚乙二醇4K，0.1M（M）pH 4.5和15%的醋酸钠(五/五)N中闪速冷冻前的乙二醇₂-气流。单晶衍射数据采集（图2)使用同步辐射可以获得最大分辨率为3.0？的本地数据集（表2). 自动索引和对系统无反射的考虑表明，这些晶体属于空间组 P（P）2₁2₁2或P（P）222₁，带有单位-细胞参数一 = 57.4,b条= 149.3,c（c）= 240.3 Å,α = β = γ = 90°. 在内部X射线探测器系统上收集到的中等分辨率的额外轴向反射揭示了空间组成为P（P）2₁2₁2.假设每个不对称单元蛋白质分子量为85 kDa（根据氨基酸序列计算），V（V）_M（M）为2.99欧^三 Da公司⁻¹相当于58.5%的溶剂含量。如果使用的分子量为110 kDa（糖蛋白分子量由SDS–PAGE测定），V（V）_M（M）降至2.31欧^三 Da公司⁻¹溶剂含量降至46.3%。然而，使用中央对手方清算所4程序集无法识别清晰的非晶体学双轴。分子替换使用基于大麦的多种搜索模型β-D类-葡聚糖外水解酶也不成功。根据从蛋白质的许多晶体中收集的衍射数据推断出的晶体细胞是同晶的，这表明MIR方法可能适合于相位测定。寻找合适的重原子衍生物的工作正在进行中。

表2 番茄蛋白酶的本地X射线数据收集统计 括号中的值是指最高分辨率外壳（3.11–3.0º）中的数据。 光束线 SRS站9.6 波长（Ω） 0.87 单位-细胞参数（Ω，°） 一= 57.4,b条= 149.3,c（c）= 240.3,α=90，β= 90,γ= 90 分辨率范围（Ω） 20–3.0 R（右）sym（对称）†(%) 14.7 (31.7) 〈我〉/〈σ(我)〉 < 3 (%) 29.1 (53.5) 完整性（%） 93.3 (85.9) 观察结果总数 314896 独立思考 42819 †R（右）sym（对称）=，其中〈我〉是对称等效反射的平均值，总和覆盖所有唯一反射的所有观测值。

图2 番茄糖酶晶体的X射线衍射图。