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第19卷
第9版
10.3390/分子190913724
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第条

口服白藜芦醇、β-葡聚糖和维生素C的联合抗应激作用

通过
瓦茨拉夫·维特维卡
*和
贾娜·维特维科娃
美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学病理学系40202
*
应向其寄送信件的作者。
分子 2014,19(9), 13724-13734;https://doi.org/10.3390/molecules190913724
收到的提交文件：2014年7月17日/修订日期：2014年8月30日/接受日期：2014年9月1日/发布日期：2014年9月3日
（本文属于特刊白藜芦醇)
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版本注释

摘要

:
人们一再发现压力会降低免疫系统对抗个体攻击的能力。目前人们对经典药物的不满导致人们更多地关注天然分子。最近的研究表明，一些生物活性分子在刺激免疫系统和减轻应激方面具有协同作用，因此我们评估了白藜芦醇-β-葡聚糖-维生素C组合的应激缓解效果。我们发现，与其单个成分相比，这种组合是压力相关症状的最强缓解剂，包括皮质酮水平和IL-6、IL-12和IFN-γ的产生。

1.简介

β-葡聚糖是结构复杂的葡萄糖均聚物，从酵母、真菌和小麦等多种来源中分离得到。50多年来，它们作为生物活性免疫调节剂的作用已被充分证明（有关综述，请参阅[1,2,三,4]). β-葡聚糖治疗的积极作用已在临床试验中反复得到证实[5]. 尽管进行了广泛的研究，但分子量或1,4等物理化学性质之间的联系与。1，6分支尚未完全建立。应该注意的是，大麦和燕麦主要含有1,3/1,4键葡聚糖，而蘑菇和酵母主要但不限于1,3/1,6键葡聚糖。然而，没有明确证据表明，特定效果仅与1,4或1,6葡聚糖有关，就像它与特定来源的葡聚糖无关一样。
评估β-葡聚糖对应激的影响的研究相当罕见。发现蘑菇衍生的β-葡聚糖可降低小鼠的抑制应激[6]燕麦β-葡聚糖能够降低运动应激的影响[7]. 在高度紧张的受试者中也发现了阳性结果[8]. 当直接比较几种不同类型的β-葡聚糖作为抗应激分子时，发现单个β-葡葡聚糖的活性水平差异很大[9].
β-葡聚糖显然不是唯一已知的免疫调节剂。越来越多的公司和/或科学家正在尝试通过添加额外的免疫调节剂来改善β-葡聚糖的作用。因此，各种天然免疫调节剂的组合越来越受欢迎。这些混合物最常见的特征是β-1,3-葡聚糖，近20年前发现它与维生素C有很强的协同作用[10]可能是因为维生素C与β-葡聚糖刺激相同类型的免疫反应。后来的研究发现，酵母衍生的β-葡聚糖和腐殖酸之间有很强的协同作用，可以增强吞噬作用、释放细胞因子并防止肝毒性[11,12]. 最近，我们的小组发现，酵母β-葡聚糖与白藜芦醇和维生素C结合，在刺激细胞免疫和体液免疫方面，包括抗癌活性方面，都有显著改善[13]. 我们的研究结果表明桑尼氏威萨尼亚大蘑菇β-葡聚糖提取物显著调节应激诱导的皮质酮水平升高[14]一项研究进一步证明了酵母β-葡聚糖和维生素C具有更强的抗应激作用[9,15]，这使我们对β-葡聚糖-白藜芦醇-维生素C混合物的抗应激活性进行了评估。

2.结果和讨论

2.1、。结果

β-葡聚糖与其他两种生物活性分子结合的原理不仅基于它们的商业可用性和既定效果，而且最重要的是基于前面描述的协同作用。β-葡聚糖通常被认为是免疫反应细胞分支的强刺激物，巨噬细胞和粒细胞是最重要的靶点。因此，我们的第一个实验重点是β-葡聚糖在与应激有关的吞噬活性变化中的作用。我们使用了合成聚合物微球（HEMA），因为它们的使用、剂量和时间在β-葡聚糖研究中已经得到了很好的确定[16]. 结果汇总于图1显示两种类型的应激都导致吞噬活性显著降低（高达30%）。β-葡聚糖和白藜芦醇-维生素C-葡聚糖（RVB）组合能够将吞噬作用恢复到正常水平。然而，这种刺激从未达到对照动物的β-葡聚糖或RVB激活水平。
以下实验测量了血清中皮质酮的水平。在对照组中，喂食混合物的任何一种单独成分都不会改变皮质酮的水平。另一方面，这两种压力都会导致皮质酮的显著增加。仅白藜芦醇或维生素C没有提供保护，而补充β-葡聚糖在一定程度上阻止了这种增加。然而，联合用药完全抑制了应激相关的皮质酮增加(图2).
分子19 13724 g001 550
图1。口服不同样品对应激小鼠外周血粒细胞吞噬作用的影响表示应力控制（PBS）和第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；VC维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
图1。口服不同样品对应激小鼠外周血粒细胞吞噬作用的影响表示应力控制（PBS）和第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
分子19 13724 g001
分子19 13724 g002 550
图2。14天的饲料补充对应激诱导的皮质酮水平的影响。*表示压力控制（PBS）和β-葡聚糖样品在第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
图2。14天的饲料补充对应激诱导的皮质酮水平的影响。*表示压力控制（PBS）和β-葡聚糖样品在第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。10只小鼠/组。
分子19 13724 g002
Con A刺激的脾细胞的IL-6基础生成量较低（约20 ng），并且仅通过β-葡聚糖和RVB组合显著增加。两种类型的应激都会降低IL-6的分泌，但只有白藜芦醇、β-葡聚糖和RVB的联合作用会使IL-6分泌高于对照（PBS）水平。在所有病例中，联合用药诱导了最高的IL-6分泌，与对照值相当(图3).
分子19 13724 g003 550
图3。14天的饲料补充对应激诱导的IL-6水平的影响。*代表应力控制（PBS）和测试样品之间的显著差异第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
图3。14天的饲料补充对应激诱导的IL-6水平的影响。*代表应力控制（PBS）和测试样品之间的显著差异第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
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当我们测量IL-12时也发现了类似的结果(图4). 这两种类型的应激都会显著抑制IL-12的形成，而白藜芦醇、β-葡聚糖或RVB组合会显著降低IL-12形成。
分子19 13724 g004 550
图4。14天喂食单个样本或组合样本对应激诱导的IL-12水平的影响。*代表应力控制（PBS）和测试样品之间的显著差异第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
图4。14天喂食单个样本或组合样本对应激诱导的IL-12水平的影响。*代表应力控制（PBS）和测试样品之间的显著差异第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
分子19 13724 g004
在干扰素-γ的情况下，β-葡聚糖和RVB组合均刺激对照小鼠的分泌。这两种类型的应激均导致IFN-γ分泌减少60%以上，而白藜芦醇可改善这种减少（仅在冷应激中显著改善）。β-葡聚糖能使应激抑制动物的分泌几乎达到正常水平(图5). 然而，单独使用β-葡聚糖或RVB组合的效果再次强得多。
分子19 13724 g005 550
图5。14天喂食不同组合样品对应激诱导的IFN-γ水平的影响。*代表应力控制（PBS）和测试样品之间的显著差异第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
图5。用组合的单个样本喂养14天对应激诱导的IFN-γ水平的影响。*代表应力控制（PBS）和测试样品之间的显著差异第页≤0.05级。PBS-磷酸盐缓冲液；维生素C；RVB-白藜芦醇-维生素C-葡聚糖组合。每组10只小鼠。
分子19 13724 g005
这两种压力都显著增加了收缩压和舒张压。补充RVB显著提高了两种水平(表1). 压力和RVB的加入都没有改变心率。仅维生素C、β-葡聚糖或白藜芦醇不会改变心率值（数据未显示）。
表
表1。受试物对血压和心率的影响。
表1。受试物对血压和心率的影响。
RVB（RVB）SBP公司数据库管理员心率
没有压力-122 ± 2102 ± 2585 ± 9
没有压力+120 ± 3101 ± 2572 ± 8
寒冷-141 ± 4110 ± 3653±9
寒冷+130 ± 2 *103 ± 2 *633 ± 9
约束-147 ± 3117 ± 4667 ± 9
约束+126 ± 4 *105 ± 2 *653 ± 7
收缩压（SBP）；收缩压（mmHg）；舒张压舒张压（mmHg）；数据代表平均值±标准偏差。*对照样品（PBS）和RVB样品之间的显著差异。在研究结束时，每组10只动物进行了测量。

2.2. 讨论

几个世纪以来，人们一直在寻找单个天然分子或复杂材料。目前人们对经典药物的满意度较低，这使得人们更加关注天然产品。β-葡聚糖可能是研究最多的天然免疫调节剂，提供了这种可能性。化学上，β-葡聚糖是葡萄糖的聚合物。β-葡聚糖有多种天然来源；然而，它们最常用于从酵母和真菌细胞壁制备（有关更多详细信息，请参阅最近的专著[17]). 尽管有10000多份关于β-葡聚糖性质的科学报告，但最近的一些研究表明，添加一种或多种生物活性分子可以提高β-葡葡聚糖的生物活性。第一个也是研究最多的具有这种协同作用的分子是维生素C[10,18,19]. 同样，添加腐殖酸可以增强β-葡聚糖的作用[11,12]或南非醉茄提取物[14].
我们的研究基于两个初步发现。首先，最近的研究表明，β-葡聚糖可以恢复因压力而抑制的某些免疫功能[6,9,20]. 其次，β-葡聚糖-白藜芦醇-维生素C组合具有优越的免疫刺激特性，包括抗癌作用[13,21].
应激与免疫反应之间的联系已得到证实，即下丘脑-垂体-肾上腺轴[22]尤其是皮质酮起主要作用[23]. 由于β-葡聚糖通常被认为主要是非特异性免疫的刺激物，我们首先评估了其对吞噬活性的影响。使用合成甲基丙烯酸羟乙基酯颗粒模型，我们发现这两种应激都显著降低了外周血中性粒细胞的吞噬活性。在这两种情况下，喂食RVB组合会将吞噬活性提高到对照（PBS）吞噬水平。然而，在对照小鼠中，吞噬作用从未达到β-葡聚糖或RVB的水平。
除了对各种免疫细胞的直接作用外，β-葡聚糖的生物作用是由于增强了几种细胞因子的分泌，如TNF-α、IFN-γ、IL-1和IL-2。这种细胞因子刺激活性取决于许多因素，包括β-葡聚糖的来源、分子量和三螺旋构象[1]. 类似地，白藜芦醇被发现可以刺激IL-2和IL-4的产生[24]和TNF-α[25]. 在我们的研究中，我们使用了三种不同的细胞因子，它们的分泌受到应激的强烈抑制。IL-12主要由巨噬细胞和树突状细胞等细胞分泌，以应对微生物因子的挑战。它也被认为是一种T细胞刺激因子[26]. IL-6是一种由多种细胞产生的多效性细胞因子。它不仅参与炎症和感染反应，还参与代谢、再生和神经过程的调节。IL-6由T细胞和巨噬细胞分泌，以刺激免疫反应，例如在感染期间和创伤后（有关综述，请参阅[27]). IFN-γ是一种对先天性和适应性免疫都至关重要的细胞因子（综述见[28]).
在我们的研究中，我们发现这两种类型的应激都强烈抑制了所有三种受试细胞因子的产生和/或释放，补充RVB组合可逆转这种抑制。β-葡聚糖单独和白藜芦醇单独也对应激相关抑制提供了强大的保护，但效果不如联合作用强。木村等。发现类似的β-葡聚糖介导的应激相关细胞因子生成抑制的恢复[6].
两种应激后皮质酮水平的显著升高与以往的研究一致（综述见[29]). β-葡聚糖单独使用和RVB联合使用都减少了应激相关的皮质酮产生的增加，这被假设有助于调节应激的负面影响。已经描述了β-葡聚糖的这些作用[9]，但β-葡聚糖-白藜芦醇-维生素C组合的协同作用令人惊讶。
压力对血压的影响有很好的记录[30]. 因此，我们对压力引起的血压变化的研究结果并不令人惊讶。只有组合有助于减少这些影响，个别成分没有影响。我们的数据相当令人惊讶，就像在小鼠模型中一样，高血压通常与肥胖、高盐饮食或遗传倾向有关[31].
我们目前的研究表明，β-葡聚糖和白藜芦醇已经确立的协同作用[32,33]可以通过添加维生素C来进一步改善。这些分子，特别是在经过充分纯化和良好表征的情况下，具有超越最初建议的非特异性免疫调节的多效性效应。似乎有可能将这种组合开发成一种减压补充剂。

3.实验部分

3.1. 动物

8周龄雌性BALB/c小鼠购自Jackson实验室（美国缅因州巴尔港）。所有动物实验均按照路易斯维尔大学IACUC协议进行。CO处死动物2窒息。每组至少使用10只动物。

3.2、。材料

酵母衍生的不溶性β-葡聚糖#300（纯度超过86%）购自Transfer Point（美国南卡罗来纳州哥伦比亚市），维生素C购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯市），白藜芦醇购自Suan Farma（美国新泽西州帕拉莫斯市）。根据HPLC分析，其纯度为98.2%反式-白藜芦醇虎杖所有这些物质均以100μg的剂量口服（灌胃）。

3.3. 吞噬作用

前面描述了利用合成聚合物微球吞噬作用的技术[15]. 简单地说，用0.05 mL甲基丙烯酸2-羟乙基颗粒（HEMA；5×10）培养外周血细胞8/毫升）。将试管在37°C下孵育60分钟，并间歇性摇动。涂片用赖特染色。含有三个或更多HEMA颗粒的细胞被视为阳性。同样的涂片也用于评估细胞类型。

3.4. 约束压力协议

根据前面描述的方法，小鼠受到束缚应激[6]. 简言之，将小鼠限制在50 mL锥形聚丙烯离心管中6小时，持续5天（从第9天开始），离心管中已钻孔。由于受限制的小鼠无法获得食物和水，因此对照组小鼠同样被剥夺了食物和水。从第0天开始，每天口服一次个体样本，持续14天。

3.5. 冷应激协议

小鼠受到冷应激[34]在4°C下培养60分钟，持续两周。在相同的时间间隔内，小鼠接受经口灌胃给药的个体样本。每天在同一时间喂食一次。

3.6. 血清皮质酮的测定

第14天，在戊巴比妥麻醉下通过静脉穿刺从小鼠身上采集血块样本。在分析之前，收集获得的血清并保存在−80°C下。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（美国德克萨斯州韦伯斯特市诊断系统实验室）测量血清皮质酮。

3.7. 细胞因子产生

纯化精子细胞（2×106/将含有5%FCS的RPMI 1640培养基中的mL）添加到24孔组织培养板的孔中。加入1μg刀豆球蛋白A后，将细胞在湿润培养箱（37°C，5%CO）中培养48小时2). 在培养结束时，收集上清液，通过0.45μm过滤器过滤，并测试是否存在IL-6、IL-12和IFN-γ。使用Quantikine小鼠IL-6、IL-12或IFN-γ试剂盒（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）测量单个细胞因子的水平。

3.8. 血压

根据制造商的建议，使用CODA监测仪（美国康涅狄格州托林顿肯特科学公司）监测血压和心率。

3.9. 统计

学生的t吨-测试wa用于对数据进行统计分析。

4.结论

近年来，天然免疫调节剂的联合应用越来越受到重视。在我们的研究中，我们将重点放在三种调节剂上，即成熟的白藜芦醇、β-葡聚糖和维生素C。我们发现，与单个成分相比，这种组合是压力相关症状（包括皮质酮水平和IL-6、IL-12和IFN-γ产生）的最强减轻剂。

作者贡献

VV设计研究；JV进行了研究并分析了数据；VV和JV撰写了论文。两位作者阅读并批准了最终手稿。

利益冲突

作者声明，关于这篇文章的发表，没有任何利益冲突。

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  • 样品可用性：可从作者处获得葡聚糖和RVB复合物的样品。

分享和引用

MDPI和ACS样式

Vetvicka，V。；韦特维科娃，J。白藜芦醇、β-葡聚糖和维生素C的口服组合的抗应激作用。分子 2014,19, 13724-13734.https://doi.org/10.3390/molecules190913724

AMA风格

Vetvicka V，Vetvickeva J。白藜芦醇、β-葡聚糖和维生素C的口服组合的抗应激作用。分子. 2014; 19(9):13724-13734.https://doi.org/10.3390/molecules190913724

芝加哥/图拉宾风格

Vetvicka、Vaclav和Jana Vetvickeva。2014.“口服白藜芦醇、β-葡聚糖和维生素C的抗应激作用”分子19，编号9:13724-13734。https://doi.org/10.3390/molecules190913724

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