理解MAPK信号通路在细胞凋亡中的作用

摘要

MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路通过多种细胞机制调节多种生物过程。在大多数这些过程中，如凋亡，MAPK具有双重作用，因为它们可以作为激活剂或抑制剂，这取决于细胞类型和刺激。在这篇综述中，我们介绍了MAPK调控的主要促凋亡和抗凋亡机制，以及一些MAPK之间观察到的串扰。我们还描述了MAPK的基本信号特性（超敏性、滞后性、数字响应），以及凋亡中存在的不同正反馈回路。我们根据刺激的强度和持续时间提供了一个简单的指南来预测MAPK的行为。最后，我们通过使用爪蟾卵母细胞作为细胞模型。正如我们将看到的，细胞凋亡受到多个正反馈回路的困扰。我们希望这篇综述将有助于理解MAPK信号通路如何参与不可逆的细胞决定。

1.MAPK级联简介

自从Sturgill和Ray检测到一种新的丝氨酸/苏氨酸激酶并对其进行表征以来，30多年过去了，这种激酶被称为MAP激酶（MAPK），因为它催化胰岛素处理的3T3-L1脂肪细胞中微管相关蛋白2（MAP-2）的磷酸化[1,2]. 两年后，MAP激酶被克隆，并命名为细胞外信号调节激酶1（ERK1）[三]. 从此，以ERK1为代表的超激酶家族引起了科学界的极大兴趣。由于大多数家族成员都参与处理生长因子刺激的信号，超级激酶家族被称为“丝裂原活化”蛋白激酶（MAPK）[4]. MAPK家族成员共享相关结构和生化特性，特别是当他们通过由MAPK、MAPK激酶（MAPKK或MAP2K）组成的所谓三层MAPK级联，通过位于激酶激活环（T-loop）中的三肽基序（Thr-X-Tyr）上的双磷酸化被激活时，和MAPK激酶（MAPKKK或MAP3K）[5]. 相反，MAPK失活是通过活化环内苏氨酸和/或酪氨酸残基的去磷酸化作用由磷酸酶介导的。丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可以实现去磷酸化[6,7]，酪氨酸磷酸酶（综述于[8])或双特异性磷酸酶（DUSP），其使激活环内的Thr和Tyr残基脱磷酸化（参见[9]). 此外，为了准确地传递信号，MAPK的激活和失活都由一些特定的支架蛋白监测。在哺乳动物中，已经确定了14个MAPK成员，分为7个亚组，包括在典型的三层模块中工作的四个常规MAPK亚组，如细胞外调节激酶（ERK1/2）、C-Jun N-末端激酶（JNK）、p38 MAPK和ERK5，以及三个不遵循经典三层的非典型MAPK亚组，双磷酸化信号结构，如ERK3/4、ERK7/8和nemo-like激酶（NLK）（综述于[10]).

过去30年来，大量研究表明，MAPK在将细胞外刺激转化为广泛的细胞反应（包括细胞生长、迁移、增殖、分化和凋亡）方面发挥着关键作用。其中，JNK和p38 MAPK在细胞暴露于由各种物理、化学和生物应激刺激引起的应激后最显著地被激活，而ERK1/2级联主要处理细胞生长因子刺激的信号[5,11]. 在这里，我们介绍了三种典型MAPK组在细胞凋亡中的作用的最新进展。将讨论MAPK在细胞死亡（促凋亡或抗凋亡）中的双重性质及其动力学。我们将考虑MAPK对不同刺激的信号特性，以及促进细胞内不可逆过程的多个正反馈回路的存在。最后，我们将解释通过使用爪蟾卵母细胞作为细胞模型。我们希望这篇综述将有助于更好地理解MAPK的复杂世界。

2.JNK和p38 MAPK级联均介导促凋亡过程

应激激活的JNKs和p38 MAPKs在平衡细胞存活和死亡对细胞外和细胞内应激的反应中起着关键作用（综述于[12]). 对凋亡的广泛研究表明，这些激酶以细胞环境特异性和细胞类型特异性的方式发挥作用，通过转录依赖性和转录依赖性机制整合不同传输点的信号，最终汇聚于半胱天冬酶激活。一般来说，半胱天冬酶可以通过外源途径或内源途径激活；前者由相应配体刺激的细胞表面死亡受体启动，后者由促凋亡Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白介导的线粒体通透性引起的线粒体外膜蛋白释放诱导[13]. 线粒体外膜释放细胞色素c是内在凋亡途径中的关键步骤。一些Bcl-2家族蛋白，包括促凋亡和抗凋亡组，在转录和/或转录后水平上受JNK和/或p38 MAPK级联的控制。三个不同的jnk公司基因和四种不同的第38页脊椎动物中的基因已经被描述出来，通过选择性转录和选择性剪接可以获得更多的“风味”。然而，不同的JNK和p38亚型在细胞凋亡调节中的作用尚不明确，本综述将不予讨论。我们将只考虑JNK1-1和JNK1-2在渗透压诱导的细胞凋亡中的作用(第8节).

2.1、。转录调控

一组促进细胞凋亡的JNK和p38 MAPK底物已被鉴定和验证[14,15]. 据报道，多种转录因子受JNK和p38调节，导致促凋亡蛋白表达增加，抗凋亡蛋白表达减少[14,16]. JNK的主要靶点是转录因子AP-1（激活蛋白1），这是一种二聚体（同源或异源二聚体）复合体，由Jun（c-Jun、JunB和JunD）、Fos（c-Fos、FosB、Fra1和Fra2）、ATF（激活转录因子）和MAF（V-MAF肌筋膜纤维肉瘤）蛋白家族的成员组成。AP-1的不同组合决定了在JNK和/或p38 MAPK级联控制下不同的基因转录谱。例如，c-Jun可以被JNK磷酸化[17]和第38页[18]激活的c-Jun可以通过其启动子中的c-Jun/AP-1增强子元件自动调节其自身在正调控环中的表达[19]. AP-1调节广泛的细胞过程，包括细胞增殖、分化、细胞存活和凋亡[20,21]. 尽管AP-1的激活与细胞凋亡有关，但其在确保细胞存活方面的作用似乎同样重要。AP-1激活的促凋亡或抗凋亡作用似乎取决于细胞和细胞外环境[22]. 除AP-1外，在凋亡中由JNK和p38 MAPK级联调节的最著名的转录因子之一是p53抑癌蛋白。在应激细胞中，JNK介导的磷酸化可以稳定和激活p53，从而促进程序性细胞死亡[23]. 像AP-1的c-Jun成分一样，转录因子p53与其他蛋白质一起工作。据报道，p53-p73二聚体在诱导凋亡细胞死亡中至关重要，尤其是在对JNK介导的细胞应激反应的反应中。活化的JNK在富含脯氨酸结构域（PRD）的Thr81处磷酸化p53，这使得p53和p73能够二聚化。p53-p73二聚体促进几种促凋亡靶基因的表达，例如彪马和bax（巴克斯）[24]. 然而，在HIV-1包膜糖蛋白复合物（Env）诱导的凋亡中，p38 MAPK通过Ser46而非Thr81的p53磷酸化促进细胞死亡[25]这可能意味着p53存在明显的二聚化状态。p38 MAPK级联反应靶向的p53伴侣蛋白是p18 Hamlet[26]. 为了应对紫外线或顺铂治疗引起的基因毒性应激，p18 Hamlet被磷酸化并稳定。磷酸化的p18哈姆雷特与p53二聚体，并刺激几个促凋亡p53靶基因的转录，例如彪马和氮氧化物[26]. 也有报道称，p53通过抑制Wip1（野生型p53诱导的磷酸酶1）以JNK依赖的方式进行正性自我调节，Wip1是一种由基因编码的p53抑制剂ppm1d（百万分之一）[27]. 即使p53是促进凋亡的主要JNK/p38 MAPK底物，在某些情况下，p53也不会被激活的JNK或p38 MAPK磷酸化。在eIF5A1过度表达诱导的细胞死亡中，JNK和p38 MAPK级联独立于p53激活促进凋亡[28]. 同样，在LPS/D-Gal（脂多糖/D-半乳糖胺）诱导的肝损伤中，AMPK（5′-腺苷单磷酸活化蛋白激酶）信号通路通过JNK活化促进细胞凋亡，但p53水平保持不变[29]. 除AP-1和p53外，其他转录因子也参与MAPK诱导的细胞凋亡。例如，在氧化应激诱导的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡中，JNK催化的磷酸化可以促进转录因子FoxO1（叉头盒蛋白O1）从其阻断蛋白14-3-3中的释放[30]. 这些数据支持MAPK信号通路以细胞上下文和细胞类型特异的方式促进凋亡的观点。

2.2. 交易后修改

除了调节凋亡蛋白的表达水平外，JNK/p38 MAPK级联还直接调节其在外源性和内源性凋亡途径中的功能。外源性途径或死亡受体途径可独立于Bcl-2家族成员诱导caspase-8活化和凋亡。然而，在一些细胞中，外源途径可以诱导caspase-8介导的前凋亡BH3-only蛋白Bid（BH3相互作用域死亡激动剂）的裂解。C末端截短型Bid（tBid）转位到线粒体并诱导细胞色素C的释放，而细胞色素C又通过内在途径诱导进一步的caspase激活（caspase-9和效应caspase-3、-6和-7）[31]. 因此，细胞凋亡的内外途径可以在线粒体中聚合。有报道称，JNK磷酸化E3泛素连接酶iTCH（itchy同源物），进而促进caspase-8抑制剂c-FLIP（细胞FLICE（FADD-like IL-1β转化酶）的泛素介导降解抑制蛋白）[32]. 有趣的是，TNFα（肿瘤坏死因子α）治疗激活JNK级联，诱导半胱氨酸蛋白酶-8非依赖性的Bid裂解；生成的Bid片段（jBid）与t-Bid不同，它易位到线粒体并选择性地促进Smac/DIABLO（第二个线粒体衍生的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活物/低pI的凋亡蛋白结合蛋白直接抑制剂）的释放[33]. 也有报道称，JNK通过在Thr59处磷酸化Bid来保护Bid免受caspase-8介导的裂解，但全长磷酸化的Bid被一种未知蛋白酶裂解以生成jBid[34]. 需要更多的研究来鉴定这种蛋白酶并揭示其在细胞死亡过程中的功能。

p38和JNK也可以调节自噬程序。RIPK（受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）和JNK的激活可诱导自噬细胞死亡[35]. 尽管自噬最初被确定为营养素饥饿期间的细胞生存机制，但自噬在介导细胞死亡中发挥着高度上下文特异性的作用。最近综述了自噬依赖性细胞死亡和其他类型细胞死亡之间的相互作用[36,37]. JNK在自噬和其他类型细胞死亡中的作用也被综述[38]. 最近，有报道称持续的p38α激活可诱导自噬，但决定了癌细胞优先进入衰老而不是凋亡[39].

在内在途径中，JNK介导的14-3-3蛋白磷酸化（几种蛋白质的细胞质锚定）诱导Bax（Bcl-2-相关X蛋白）释放并转移到线粒体[40]以及促凋亡蛋白Bad（Bcl-2细胞死亡拮抗剂）和FOXO3a的释放[41]. JNK和p38可以直接磷酸化和调节Bcl-2蛋白家族几个成员的功能。JNK可诱导Bad在Ser128的磷酸化，促进Bad的凋亡作用[42]. p38和JNK诱导Bax磷酸化和线粒体易位促进细胞凋亡[43]. Bim（Bcl-2-like protein 11）的促凋亡活性取决于JNK催化的Ser65磷酸化[44]或p38 MAPK[45]. 在紫外线诱导的凋亡过程中，通常由肌动蛋白和肌球蛋白V运动复合物隔离的Bim和Bmf（Bcl-2修饰因子）通过JNK依赖性磷酸化释放[46]. Bim和Bmf是仅BH3的蛋白质，与Bcl-2样分子相互作用以中和其抗凋亡作用。

此外，JNK和p38可能抑制抗凋亡Bcl-2家族成员的功能。已经证明JNK可以磷酸化Bcl-2[47,48]和Mcl-1（髓细胞白血病1）[49]从而抑制其抗凋亡功能。在Fas诱导的细胞死亡中，p38的激活减弱了线粒体中抗凋亡蛋白Bcl-xL（特大型B细胞淋巴瘤）和Bcl-2的积累[50].图1总结了促进线粒体释放细胞色素c的所有已知JNK底物。

3.JNK和p38 MAPK级联也介导抗凋亡过程

JNK和p38 MAPK级联不仅促进促凋亡过程；它们也参与抗凋亡机制。有许多由转录调控介导的抗凋亡过程的例子。通过激活ERK和JNK通路，需要BNIP3上调，以保护角质形成细胞免受UVB诱导的凋亡[51]. JNK激活通过增强几种抗凋亡蛋白的表达减轻内质网（ER）诱导的细胞死亡[52]. thapsigargin和tunicamycin诱导的内质网应激通过JNK信号通路导致TRPV6（瞬时受体电位香草醛通道6）表达增加，从而保护人胚胎干细胞源性心肌细胞（hESC-CMs）免受凋亡细胞死亡[53]. 此外，JNK/c-Jun信号通路促进annexin A2的过度表达，从而抑制p53的表达，从而减少p53调节的凋亡基因[54]. 在氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的巨噬细胞凋亡中，p38 MAPK信号通路激活诱导孤儿核受体Nur77表达，通过抑制凋亡提高细胞存活率[55].

在翻译后水平上，ERK1/2对Thr125处caspase-9的磷酸化可以抑制有丝分裂过程中固有的凋亡[56]. 然而，在小鼠胚胎成纤维细胞对高渗应激的急性反应中，抑制性磷酸化是由p38 MAPK而不是ERK1/2催化的[57]. 据报道，JNK的瞬时激活通过JNK与Apaf 1和细胞色素c的直接相互作用延迟caspase-9的激活，从而抑制凋亡小体复合体[58]. JNK抗凋亡功能的另一个例子是Bad在Thr201的磷酸化，它促进抗凋亡蛋白Bcl-xL从Bad中分离[59]. 最近有报道称，p38 MAPK/MK2在细胞质复合体中与RIPK1相互作用，MK2在Ser321/336磷酸化RIPK1，以响应促炎刺激和病原体，从而抑制RIPK1自身磷酸化，从而抑制依赖RIPK1的细胞凋亡和坏死[60].

因此，正如我们在前面章节中所看到的，JNK和p38信号通路的激活可以诱导或阻止细胞凋亡。在第6节，我们将提供一个简单的指南来了解MAPK信号功能。

4.MAPK信号交叉信号：JNK和p38并不总是协调工作

看起来JNK和p38总是协调工作，但事情更复杂。JNK和p38 MAPK之间的串扰信号正在成为应激反应的一种重要调节机制。JNK和p38 MAPK通路共享几个上游调控因子，因此存在多种刺激同时激活这两条通路；然而，有证据表明p38 MAPK通路在几种情况下可以负调控JNK活性。p38的化学抑制大大增加了JNK的激活[61]，并删除p38α基因诱导的小鼠JNK激活[62]. Wada等人报道，JNK和p38信号通路之间的平衡决定了细胞命运，并将环境和发育应激与细胞周期阻滞、衰老、致癌转化和成体组织再生联系起来[63]. 这些作者还表明，JNK和p38对Cdc2的拮抗调节可能是不同应激途径控制细胞命运的检查点之一。斯台普斯等人证明，UV-C诱导的p38激活增加了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中MAPK磷酸酶-1（DUSP1）的水平，并且DUSP1通过失活JNK来保护这些细胞免受UV-C诱导的凋亡[64]. 最近，通过分析单细胞对紫外线胁迫的反应，有报道称p38诱导的DUSP1与JNK活性呈负相关，这种交叉抑制产生了JNK活动的细胞异质性[65]. 虽然p38导致细胞间DUSP1蛋白水平的变化，但其分子机制尚不清楚（见结论）。总之，当JNK活性超过阈值时，细胞将被判处死刑[65].

5.ERK在细胞凋亡中的两面性

ERK1/2激活通过控制细胞增殖和分化与抗凋亡功能广泛相关[11,66]. ERK可以通过转录和翻译后机制下调促凋亡蛋白和上调抗凋亡蛋白来抗凋亡（参见[67]). 然而，有几个例子表明ERK1/2信号可以促进凋亡（参见[68]).

细胞周期阻滞和细胞周期再进入均可诱导细胞凋亡。天冬氨酸B通过ROS非依赖性ERK和p38 MAPK激活诱导G2期细胞周期阻滞和凋亡[69]. 据报道，G2相位延迟和G2检查点停止的阻塞退出均由关键G2/M调节器Cdc25B的MEK1依赖性失稳介导[70]. 处于G0状态的有丝分裂后神经元试图重新进入细胞周期，以应对压力信号，从而导致细胞死亡。例如，有报道称，β-淀粉样肽通过MEK-ERK激活诱导细胞周期蛋白D1表达增加，从而促进S期进入和神经元细胞死亡[71].

不同的损伤可以通过激活ERK信号通路诱导细胞凋亡。顺铂诱导的DNA损伤激活ERK1/2并增加p53蛋白水平[72]. 作者还发现ERK1/2与p53相互作用并诱导p53在Ser15的磷酸化。因此，ERK信号通路上调p53可能是DNA损伤诱导凋亡的机制之一。在全氟己烷磺酸（PFHxS）诱导的PC12细胞神经毒性中检测到不同动力学下ERK1/2、JNK和p38 MAPK的激活。ERK抑制剂显著减少细胞凋亡，而JNK抑制剂显著增加细胞凋亡，然而p38 MAPK抑制剂没有影响[73]. ERK1/2激活也有助于NSC 95397（一种醌基小分子化合物）在结肠癌细胞中的抗增殖和凋亡作用[74]. 谷氨酸诱导的神经元氧化毒性与ERK持续激活有关，ERK抑制可保护细胞免受谷氨酸毒性[75]. TNFα和NMDA（N-甲基-d-天门冬氨酸）联合刺激诱导小鼠皮层神经元ERK信号转导和细胞死亡，MEK/ERK抑制对其有保护作用[76]. 然而，当结论完全基于化学抑制剂的影响时，应小心。最近有报道称，ERK可以通过磷酸化前融合蛋白丝裂原融合蛋白（MFN）1促进细胞凋亡，以应对氧化应激和氧-葡萄糖剥夺，因为磷酸化的MFN1与前凋亡Bcl-2家族成员Bak（Bcl-2同源拮抗剂杀伤剂）有很高的亲和力[77].

6.了解MAPKs调控的细胞凋亡的简易指南

考虑到MAPK在细胞凋亡调控中的各种相互矛盾的作用，我们能否提出一些简单的规则来理解MAPK的行为？有可能预测激活MAPK的应激反应是否会导致细胞死亡？换言之，我们能否在不重复“MAPK在凋亡中的功能取决于细胞类型和刺激物”这一常见咒语的情况下说出一些有见地的话？让我们试试看。

首先，MAPK必须具有适合处理和传播外部或内部刺激的信号特性，这些刺激在面临有害情况时，将决定细胞是否能够存活并修复损伤，或者是否会因凋亡而死亡。激活的信号通路的动力学和强度以及信号环路的存在都很重要。接下来，我们将描述决定是否参与细胞死亡程序的MAPK的基本属性，以及所涉及的正反馈回路。

6.1. MAPKs的基本信号传导特性

MAPK作为细胞传感器和开关，在调节细胞命运决定中发挥着关键作用。细胞传感器必须具有适合处理和传播促进不可逆过程的刺激的信号特性。基本上，这些特性是：（1）超敏性，即在超过阈值后，刺激的少量增加会产生非常大的反应；（2） 滞后，一种生化记忆形式，反映在刺激消失时MAPK的持续激活；和（3）数字响应，即在单个单元级别上的全或单响应[78] (图2).

超敏反应在许多生物过程中很常见。至少有四种不同的机制可以产生超敏反应。这些包括零级超敏、多点超敏、抑制剂超敏和正反馈回路[79,80]. 正反馈回路和负反馈回路也是生物信号系统中常见的调节元件。正反馈是指将输出信号反馈给输入的一组调节步骤[81] (图2D） 。嵌入在正反馈回路中的超灵敏系统有可能表现出双稳态行为，在离散稳定稳态之间切换，而不能停留在中间状态[82,83,84]. 双稳态系统的三个特征是强超敏性、单个细胞水平的数字响应和滞后。这类系统的例子包括JNK对高渗性休克的反应和ERK对孕酮的反应，这在James E.Ferrell年的优雅著作中有所描述爪蟾卵母细胞是研究这些特性的合适细胞模型[85,86]. 我们还通过使用爪蟾卵母细胞。p38对渗透压的反应是超敏的、双峰的，并且具有低滞后性[87].

在哺乳动物细胞中，JNK信号对不同刺激也表现出超敏反应，在单个细胞水平上表现出开关样反应，但没有滞后性[88]. 值得注意的是，在哺乳动物细胞中，PDGF（血小板衍生生长因子）激活ERK并不是超敏反应，在单个细胞水平上表现出分级反应，但ERK的分级激活在激酶级联下游转化为更具开关性的行为（数字反应），在即时-早期基因诱导水平[89]. 作者还发现，尽管ERK激活被分级，但ERK定位到细胞核内呈现全或单（数字）行为，这表明控制ERK核移位和/或保留的未知机制可能是下游超敏反应的原因。在酵母菌属据描述，p38的同源物Hog1（高渗压甘油1）在增加盐浓度后逐渐积累在细胞核中，但获得的转录产物是双峰的[90].

由于在单个细胞水平上获得的开关样反应在MAPK和其他蛋白激酶中很常见，我们提出了一个用于细胞决策的数字模型。通过将细胞类比为信息设备，将蛋白激酶类比为计算机中的晶体管或芯片，我们可以想象出生成数字信息以“运行”不同程序（如细胞死亡程序）的激酶网络。因此，基于数字响应生成的传感、集成和选择的通用模型可以应用于不同的生物过程[78].

6.2. 强信号与弱信号、持续信号与瞬态信号

MAPK的超敏特性和下游目标激活阈值的存在可以解释MAPK激活后获得的数字输出。我们观察到JNK对高渗山梨醇的反应是开关型的，在细胞色素c释放的临界期后，初始分级反应转化为数字反应[91]. 正如我们稍后将看到的，有多个反馈回路可能会对观察到的数字响应产生影响。调节细胞凋亡的两个重要因素是信号的强度和持续时间。众所周知，MAPK激活的促凋亡或抗凋亡作用取决于信号的持续时间。例如，短暂的JNK激活可以促进细胞存活，而延长JNK的激活可以诱导细胞凋亡[92]. p38磷酸化的持续时间似乎对调节细胞命运也至关重要，因为持续激活与凋亡有关[93]而瞬时磷酸化与存活相关[94]. 例如，在接触渗透性或热休克的SKT6细胞中，JNK和p38 MAPK的短暂激活促进红系分化，而JNK与p38 MAPK的长期激活导致细胞凋亡[95]. 在酵母中，p38（Hog1）的持续激活通过促进高水平的活性氧（ROS）导致严重的生长缺陷和细胞死亡[96]. ERK1/2持续激活促进谷氨酸诱导的神经元细胞氧化毒性[75]. 有人提出，ERK持续激活的主要原因是细胞死亡过程中ROS的存在[68]. 然而，ERK信号的持续激活不仅与细胞凋亡有关，还与细胞周期进展、细胞转化和分化有关[97].

虽然人们普遍认为强度和长信号持续时间与参与凋亡有关，但这在分子水平上并没有得到很好的解释。调节细胞色素c释放和caspase激活的不同靶点如何对MAPK信号的动力学和强度敏感？我们认为强烈的MAPK激活（主要是JNK和p38）可能足以超过激活特定促凋亡靶点的阈值水平。类似地，MAPK的持续激活可以激活其他通常不被瞬态信号激活的靶点。靶标对活化的MAPKs的亲和力可能是确定哪些靶标首先被活化（抗凋亡），哪些靶标随后被活化（促凋亡）的重要因素。换句话说，促凋亡靶点与MAPK的亲和力较低，但当MAPK活性较高和/或持续时，这些靶点可能被激活，这意味着活化的MAPK数量增加可以与其他靶点相互作用。

例如，据报道，在体外和注射的卵母细胞中，组成活性MKK6浓度的增加会单独激活p38α（低MKK活性）或同时激活p38β和p38γ（高MK6活性）[98]. 有趣的是，已有研究表明，细胞周期磷酸化的时间顺序取决于底物蛋白的内在属性：良好的激酶底物往往在早期磷酸化，而良好的磷酸酶底物往往是在晚期磷酸化[99,100,101].

6.3. 反馈回路可以解释复杂的生物过程

道格拉斯·R·霍夫施塔特（Douglas R.Hofstadter）在其富有洞察力的书中写道：“我是一个奇怪的循环“2007年出版[102]，提出意识可能是符号之间错综复杂的相互作用的结果，符号在分子水平上还没有很好的定义，但可以表示为激活的神经元簇。霍夫施塔特还提出，在这个复杂的符号交互网络中存在多个反馈回路可能是进化大脑中“我”或意识的原因。

霍夫施塔特指出，乍一看，反馈回路对大多数人来说可能看起来很奇怪，甚至很危险，但科学家们对此更为熟悉。反馈控制广泛存在于不同的生物系统中，对于调节发育过程中的细胞间信号传递非常重要（综述于[103]). 反馈回路在细胞内信号传递中也很常见，可以在空间和时间上调节细胞反应并控制细胞命运[81]. 负反馈回路在细胞系统中众所周知，是维持体内平衡所必需的。1933年鲁道夫·肖恩海默首次证明了生物合成途径的最终产物反馈抑制（胆固醇稳态）[104]; 最近的一个例子适用于控制铁稳态的负反馈回路[105]. 负反馈回路也会产生振荡[84,106]. 事实上，已经报道了许多正反馈回路的例子，这些回路可以放大信号，改变信号响应的时间，并创建双稳态开关[84,106,107]. 我们接下来将看到，这些正反馈回路是解释凋亡过程不可逆性的基础。

6.4. 细胞如何通过正反馈回路死亡

当刺激消失时，MAPK的超敏反应和持续激活可能是达到阈值时正反馈回路参与的结果。在细胞死亡程序中，报告了多个正反馈回路(图3). 线粒体释放的细胞色素c诱导caspase-9和随后的caspase-3活化，进而产生Bcl-2蛋白水解，从而在正反馈回路中促进更多的细胞色素c释放和caspase-9/-3活化[108]. 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8的Bid蛋白水解产生tBid，tBid诱导细胞色素c释放、caspase-9和caspase-6活化，caspase-8反过来促进蛋白水解和活化，从而关闭恶性循环[109]. caspase-3诱导的Bid蛋白水解也有类似的环[110,111]. Caspase-3还可诱导Caspase-9的直接蛋白水解和完全激活，被认为是一个正反馈环[112]. 然而，Denault等人发现，凋亡小体复合体内的caspase-9二聚体（导致其自催化裂解）需要随后被caspase-3裂解，从而释放XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）对caspase-8的抑制作用[113]. 这些作者将这种机制称为减压而非反馈激活[113]，尽管这是一个没有实际意义的问题[114]. 蛋白酶-3也是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8的底物[115]，使caspase激活网络更加复杂(图3A） ●●●●。最近，利用CRISPR-Cas9基因靶向，系统分析了半胱天冬酶在人类白血病细胞系化疗诱导细胞死亡中的个体和联合作用，已经表明，效应胱天蛋白酶-3或-7的激活通过诱导顶端胱天蛋白酶（胱天蛋白酶-8和-9）的完全激活而产生反馈扩增和有效的凋亡细胞死亡[116]. 本研究强调了效应器半胱天冬酶在参与正反馈回路以实现有效细胞死亡中的重要作用。

通常，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是激酶的底物，而激酶是死亡握柄中半胱氨酸蛋白酶的底物[117]. MEKK1（MAPK/ERK激酶激酶1），一种最终能激活JNK和p38的MAPKKK[118]在失巢、Fas刺激和DNA损伤期间被caspase-3裂解[119,120,121]. 获得的片段是一个组成活性MEKK1，它依次促进细胞色素c释放和caspase-9/-3活化(图3A） ●●●●。

在JNK/p38 MAPK级联中，第二信使活性氧（ROS）以正回路调节MAPK的激活。据报道，NADPH氧化酶产生的ROS激活JNK，JNK反过来激活正反馈回路中的NADPH酶[122]. 也有报道称，在镉诱导的细胞凋亡中，NADPH氧化酶2的激活通过ROS生成和蛋白磷酸酶5（PP5）失活激活JNK，而JNK的激活反过来增加NADPH酶及其调节蛋白（p22phox、p40phox，p47phox和Rac1）的表达，促进ROS生成，从而形成正反馈回路[123]. Shi等人报告说，ROS的生成会诱导JNK的激活，而JNK又会通过p53的激活来诱导ROS的产生[27]. 在顺铂诱导的细胞凋亡中，观察到p53激活、ROS生成和p38激活之间存在类似的反馈回路，而p38激活反过来又诱导p53激活[124]. 持续激活p38可引起重要的代谢变化，并提高呼吸速率，从而增加线粒体活性氧的产生，从而促进p38诱导的细胞凋亡[125]. 在异莲心碱诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡中，活性氧的产生激活了JNK和p38 MAPK信号通路，p38的激活也诱导了正反馈回路中活性氧的升高[126].

ASK1（凋亡信号调节激酶1）是JNK和p38 MAPK的MAP激酶激酶（MAP3K），优先被ROS激活（综述于[127]). 因此，任务1−/−胚胎成纤维细胞对H具有耐药性₂O（运行）₂-JNK和p38 MAPK的诱导凋亡和持续激活丢失[93]. 最近有报道称，ω-3-17,18-环氧氯乙酸（C20E）刺激TNFR1（肿瘤坏死因子受体1）激活ASK1-MKK4/7-JNK/p38 MAPK信号通路，导致Bid裂解[128].

ASK1参与不同的正反馈回路。TNFα治疗通过阻止其蛋白酶体依赖性降解在ASK1介导的途径中诱导Daxx（死亡相关蛋白6）蛋白的积累，Daxx诱导ASK1的激活[129]. 在胃癌中，ASK1过度表达通过AP-1激活诱导细胞周期蛋白D1的转录，而ASK1水平又通过Rb-E2F（retinoblastoma-E2F transcription factor，视网膜母细胞瘤E2F转录因子）途径由细胞周期蛋白D1调节[130].

除活性氧外，神经酰胺是另一种与凋亡相关的第二信使。据报道，神经酰胺可以通过Rac1或ASK1调节的JNK/p38 MAPK级联激活来启动细胞凋亡[131]. JNK信号通路通过中性鞘磷脂酶（nSMase）磷酸化刺激神经酰胺生成并促进细胞凋亡[132]. 因此，JNK活化和神经酰胺生成之间存在正反馈回路。总之，不同的正反馈回路可以促进JNK/p38信号通路的持续激活(图3B） ●●●●。

7爪蟾卵母细胞作为理解细胞凋亡的细胞模型

爪蟾卵母细胞是研究细胞死亡机制的一个非常有用的系统。基于爪蟾鸡蛋提取物用于描述线粒体凋亡途径和细胞色素c释放在caspase激活中的作用的开创性实验[133,134]. 此外，爪蟾卵母细胞可以作为体内系统使用，因为当这些细胞受到不同的应激时，会启动线粒体凋亡途径。Bcl-x（S）的表达[135]通过抑制戊糖磷酸途径诱导卵母细胞营养物质耗竭[136]中性鞘磷脂酶诱导神经酰胺[137]或高渗性休克[91]促进细胞凋亡爪蟾卵母细胞。这些细胞可能适合研究癌症的代谢调控，因为卵母细胞表现出与癌细胞相似的代谢改变及其凋亡机制[138]. 除了环境刺激外，在未受精的减数分裂成熟过程中，凋亡机制也可以自发启动爪蟾鸡蛋[139].

爪蟾与其他系统相比，卵母细胞具有更好的操作性，特别适合于单细胞水平的生化测定。例如，可以通过Western blot测量单个细胞中MAPK的激活和细胞色素c的释放。将带帽RNA微注射到卵母细胞中，高效表达蛋白激酶的组成性活性突变体或显性阴性突变体。也可以微量注射抗体、反义寡核苷酸或其他不能穿过细胞膜的分子，以操纵任何特定的信号通路。重要的是，细胞色素c微量注射爪蟾卵母细胞诱导caspase-3活性[140]，使对cythochrome c释放激活的信号通路和caspase参与的正反馈回路的研究变得负担得起[87,111]. 最近，通过使用爪蟾卵母细胞和卵子提取物，研究表明正反馈回路允许细胞凋亡在自我生成的触发波中通过细胞质扩散，这与caspase激活有关[141].

8.高渗电击诱导细胞凋亡中的MAPK动力学

高渗压通过促进水流出细胞、触发细胞收缩和细胞内脱水对细胞产生许多破坏性影响[142]. 细胞已经发展出适应渗透变化的生存机制[143]但当压力强烈或持续时，它会触发细胞凋亡[144,145,146,147,148].

在过去的几年里，我们分析了调节渗透压诱导的细胞凋亡的机制爪蟾卵母细胞。我们报道了高渗应激诱导细胞色素c释放和caspase-3激活[91]. 我们还描述了凋亡过程中的时间进程事件以及应激蛋白激酶、钙蛋白酶和Smac/DIABLO的作用。高渗性休克在释放大量细胞色素c以促进caspase-3活化之前（晚期事件），会导致钙蛋白酶快速激活和线粒体高水平Smac/DIABLO释放（早期事件）[149]. 高渗性休克也很快激活p38和JNK信号通路[87,91]. 同时抑制p38和JNK通路可减少渗透压诱导的凋亡，而这些激酶的持续激活可加速细胞色素c和caspase-3活化的释放。因此，渗透压早期诱导的至少四种不同的途径会聚在线粒体上触发细胞凋亡[149].

最近，我们研究了高渗休克激活的JNK亚型及其在细胞凋亡中的作用。来自jnk1型基因在C末端呈现选择性剪接，产生短和长JNK1变体（分别为JNK1-1和JNK1-2）。我们已经证明，JNK1-1和JNK1-2在渗透压作用下早期被激活，这两种亚型的持续激活加速了凋亡程序。随后，当半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3被激活时，JNK1-2在Asp385处被蛋白质水解，增加细胞色素c和半胱氨酸蛋白酶-3活性的释放，从而形成正反馈回路[111]. 由于断裂的JNK1-2和JNK1-1具有相似的氨基酸序列C类-与JNK1-1相比，短JNK1-2片段的表达具有明显的凋亡效应，这意味着JNK1-3片段的最后一个氨基酸可能对调节JNK12分裂后参与的正反馈回路中细胞色素c的释放和caspase-3的激活起重要作用[111].

此外，一种未知蛋白酶在Asp52诱导Bid和单-双蛋白Bid的早期蛋白水解，这反过来增加了细胞色素c和caspase-3活性的释放，进而产生Bid的大量蛋白水解，从而形成第二个正反馈回路[111]. 有趣的是，我们还报道了细胞色素c微量注射在爪蟾卵母细胞通过caspase-3激活诱导p38磷酸化，caspase抑制降低了渗透压诱导的p38激活水平，表明高渗休克参与了第三个正反馈回路[87]. 此外，有报道称，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶可以诱导钙蛋白酶抑制剂钙蛋白酶抑制剂的蛋白水解[150,151]从而增加正循环中钙蛋白酶的激活。总之，高渗性休克诱导了不同途径的激活，这些途径集中于半胱氨酸蛋白酶-3的激活，半胱氨酸酶-3通过激活多个正反馈环参与不可逆的凋亡程序。

渗透压诱导的细胞凋亡模型爪蟾卵母细胞出现在图4该模型由两个不同的相组成：可逆相和不可逆相。在可逆期，抗凋亡和促凋亡反应同步发生，包括Smac/DIABLO的快速释放、钙蛋白酶激活、早期Bid裂解和JNK/p38 MAPK磷酸化。这些途径将汇聚在线粒体上，触发caspase-3激活。卵母细胞在可逆阶段不会死亡，当压力消除时可以恢复。MAPK（JNK和p38）是应激传感器，可激活早期抗凋亡底物（A、B、C），但MAPK的强烈和/或持续激活可激活晚期促凋亡底物（X、Y、Z）。这些尚未表征的底物可能包括不同的Bcl-2家族成员。线粒体整合可用信息来调节细胞色素c的释放，细胞色素c在胞浆中达到阈值水平后激活半胱氨酸蛋白酶-3，半胱氨酸酶-3与多个正反馈环结合，从而产生不可逆转的死亡。

9.结束语

MAPK通过转录和转录后机制调节细胞凋亡。虽然p38和JNK的激活通常与促凋亡作用有关，ERK的激活与抗凋亡作用有关。此外，JNK和p38 MAPK之间的MAPK信号串扰是应激反应的另一种调节机制。MAPK在细胞死亡（促凋亡和抗凋亡）中的双重作用可部分解释为通过不同刺激激活的靶点的多样性，或特定刺激作用的分子背景（所考虑的细胞类型）。然而，即使在暴露于特定刺激的特定细胞类型中，MAPK信号通路的激活也可能是促凋亡和/或抗凋亡的。这种悖论可以部分通过MAPK信号系统的基本性质来解释。MAPK的超敏特性和激活阈值的存在解释了为什么强烈和/或持续激活MAPK是促凋亡的，而微弱和/或短暂激活是抗凋亡的。为了更好地理解MAPK的行为，有必要对磷酸化的时间顺序进行进一步研究，包括早期的抗凋亡靶点和晚期的促凋亡靶点。底物对MAPK的差异亲和力似乎可以解释MAPK的动力学和双重性质。第二个悖论是为什么一些细胞在同一时间接受相同剂量的刺激后能够存活，而另一些细胞则会死亡。MAPK的信号特性，包括多个正反馈回路的存在，解释了为什么单个细胞暴露于中等水平的压力下，会出现全或单（数字）反应。然而，这种异质反应的分子原因尚不清楚。正如我们之前指出的，有报道称，紫外线胁迫通过p38激活MAPK磷酸酶-1（DUSP1）蛋白水平的变化，在JNK活性中产生细胞异质性[65]. 然而，尚不清楚DUSP1诱导在细胞之间如何变化。有人提出基因表达的内在噪音会产生细胞异质性，即非遗传异质性[152]. 有趣的是，已有研究表明，细胞在促凋亡因子和抗凋亡因子中呈现异质性成分，这是TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）诱导的凋亡中细胞间死亡时间和概率变异的主要原因[153]. 在大多数类型的细胞死亡中，可能存在由不同蛋白质和信号通路（包括MAPK）引起的多变量控制。因此，预测单个细胞在压力下的命运可能很困难，但并非不可能，因为这需要整合从不同因素获得的信息。

在这里，我们描述了细胞凋亡中存在的多个正反馈回路。这些环路对于在空间和时间中产生自持的触发波（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和/或激酶）至关重要。图5是前面描述的复杂信令环路的简化版本。这种模块化结构可能是实现细胞不可逆变化的一般机制，因此可能应用于其他生物过程，尽管涉及的激酶和蛋白质可能不同。例如，ERK信号通路被孕酮激活爪蟾通过激活Cdc2/细胞周期蛋白B（MPF）复合物调节卵母细胞减数分裂进程，尽管JNK不参与[154]. 已经描述了这种生物过程的几个正反馈回路，以确保ERK2和MPF的持续激活，从而促进卵母细胞的不可逆成熟[155,156,157,158].

对MAPK的评论总是会显示出令人困惑的图像。这一点也不奇怪，因为MAPK参与多种过程，而细胞信号传递是一个复杂的世界。然而，在这里，我们试图提取和提取有关MAPK信号和功能的一些原理。了解MAPK信号通路可以让我们深入了解细胞如何在刺激前做出决定。对于生物学家来说，这无疑是一项有益的活动。