ApoE缺乏动物中老年小鼠肝细胞和心肌细胞超微结构的老化相关变化增强

摘要

生物老化与各种形态和功能变化有关，但这些现象在许多组织和器官中的机制尚不清楚。高脂血症是肝脏和心脏衰老的因素之一。在这里，我们分析了成年（7月龄）和老年（17月龄）小鼠的形态学、超微结构和生化特征，然后比较了野生型（C57Bl/6株）和ApoE缺陷型（转基因ApoE^−/−)动物。老年动物肝细胞中受损线粒体、溶酶体和脂质沉积的数量增加。重要的是，ApoE缺乏动物的肝细胞中这些与衰老相关的变化明显更强。老年动物心肌细胞中受损线粒体数量增加。然而，野生型和ApoE基因缺陷小鼠之间的差异表现在转基因动物中检测到的线粒体较大。此外，野生型和ApoE基因缺陷小鼠在血浆生化标记物水平上存在一些与衰老相关的差异。老年人ApoE血浆中胆固醇和HDL水平升高^−/−小鼠和老年野生型动物的血浆中均显著高于。另一方面，老年ApoE患者血浆丙氨酸转氨酶（ALT）活性下降^−/−小鼠血浆中的含量明显低于老年野生型动物。

1.简介

衰老的特征是基因组、细胞、组织和全有机体水平的内稳态逐渐丧失，导致应对压力的能力下降，功能下降，发病和死亡风险增加[1，2]. 这些变化是严重疾病的主要风险因素，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病[2，三]. 受损大分子和细胞器的积累是衰老细胞中最持久的变化之一，与不同分解代谢途径的下降有关。在细胞水平上，氧化损伤的特征是线粒体、溶酶体、内质网受到破坏[4]. 线粒体负责ATP的生成，并调节许多与年龄相关的途径，包括衰老、自噬和炎症[5，6]. 线粒体被认为是超氧阴离子（O）的主要细胞内来源₂^负极)，也是自由派攻击的主要目标。线粒体呼吸链产生的ROS损伤线粒体成分，包括蛋白质、脂质和线粒体DNA[7，8，9，10，11].

衰老的迹象取决于器官的类型，反映了器官的解剖和功能。肝脏是一个复杂的代谢器官，具有广泛的功能，包括解毒、蛋白质合成和产生消化所需的化合物[12]. 衰老肝脏中某些与年龄相关的变化有助于系统对年龄相关疾病的易感性[13，14]. 基因组和表观基因组的改变促进了这一过程，这些改变导致线粒体功能和营养敏感途径的失调。细胞衰老和低度炎症直接影响不同类型肝细胞的多种表型变化，即肝细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞和Küpffer细胞[12，15]. 据报道，各种与年龄相关的肝脏变化，如肝细胞增大、双核细胞数量增加和线粒体数量减少[16，17，18]. 这些变化可能会显著影响肝脏的形态、生理和氧化能力。同样，生物老化促进心脏和血管系统的渐进性结构改变。这些变化包括血管硬化、左心室壁厚度增加、随着年龄增长而纤维化，以及老年心脏所经历的一些功能变化和代偿反应，这些变化降低了其对增加负荷和降低储备能力的反应能力[19]. 心肌线粒体中与衰老相关的变化包括其含量和形态的变化、电子传递链复合体（ETC）的活性、线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放、活性氧的形成和线粒体动力学。由于心血管疾病的发病率随着年龄的增长而增加，线粒体功能受损与个体更容易患上各种与年龄相关的心血管疾病有关[20，21].

吸烟、紫外线和其他环境因素加速了老化过程[22，23，24]. 此外，肥胖、动脉粥样硬化和血脂异常会产生多种变化，可能导致肝脏和心脏形态的改变，从而导致器官功能障碍[8，25]. 阿波（ApoE）^−/−小鼠是一种实用的高脂血症和动脉粥样硬化模型。这是因为这些小鼠表现出延迟的脂蛋白清除，因此即使在正常饮食时，也会出现高脂蛋白血症、脂蛋白异常血症、严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化病变[26]. 在此，我们旨在探讨高脂血症对心脏和肝脏衰老的假设作用。分析成年（7月龄）和老年（17月龄）小鼠的形态学、超微结构和生化特征，然后比较野生型C57Bl/6和转基因ApoE小鼠的年龄相关特征^−/−动物。

2.材料和方法

动物。雄性C57Bl/6J小鼠，野生型（wt）或纯合ApoE缺陷型（ApoE^−/−)购自Charles River Laboratories（Research Models and Services，Sulzfeld，Germany GmbH）；不同基因型组不是一窝。在每组中，我们包括10只动物。这些动物被保存在室温（21°C）下，自然控制12:12的明暗比例，并在实验室随意喂食。老鼠被定期喂食。在7个月（成人）和17个月（老年）时，通过颈椎脱位将动物处死，并立即取肝脏和心脏组织进行进一步分析。所有程序都是按照机构指南以及国家和国际法律和政策进行的，该研究得到了波兰卡托维兹市相应的动物实验地方道德委员会（编号：72/2012）的批准。

超微结构分析小鼠断头后立即切除左肝叶远端和心室肌碎片。将两种组织切成适当大小的块（2 mm^三)并在4°C下将其在缓冲的3%戊二醛中浸泡在二甲氨基甲酸盐缓冲液（pH 7.2）中至少2 h。然后将组织标本在4°C的碳酸钙缓冲液（pH 7.2）中的2%四氧化锇中固定1 h。使用升序系列乙醇对固定组织进行脱水，然后通过环氧丙烷转移到环氧树脂中[27]. 最后，将肝脏和心脏样本嵌入DDSA/NMA/Embed-812混合物中（英国斯坦斯特德Agar Scientific Ltd.）。在Reichert-Jung超薄切片机上切割超薄切片（40–60 nm），并用乙酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。使用透射电子显微镜Tesla BS-500和Frame Transfer-1K-CCD-Camera（德国慕尼黑TRS）对超微结构进行评估。使用来自每个试验组的四只小鼠来评估超微结构分析。此外，为每组小鼠制备12个epon阻断剂。从每个树脂块中分析了三个网格。对每组动物的100张随机电子显微照片进行线粒体和溶酶体的形态分析。计算每个动物组每个细胞的平均细胞器数。还测量了线粒体的长度（µm）。使用Microsoft Excel的XLSTAT插件对结果进行统计处理。通过对Kruskal–Wallis秩检验（ANOVA的非参数替代方法）进行多途径（年龄、遗传群）分析，可以识别出不同水平差异的显著影响第页-值。此外，使用Dunn检验进行了多次成对比较，以分析每对之间的差异；第页<0.05为显著性阈值。

组织形态学分析为了进行组织形态学分析，使用Reichert-Jung超薄切片机（奥地利维也纳Reichert）制备肝脏和心脏半薄切片（500 nm），用甲苯胺蓝染色，并使用光学显微镜Zeiss Axio Scope（德国Oberkochen）进行检查。A1配备黑白数码相机。使用Photoshop CS6软件（Adobe）确定脂质沉积区域，使用黑色样本颜色区域工具（R=0；G=0；B=0），然后在直方图窗口中记录像素数。每组随机抽取3张图片进行像素计数。共制备10个半薄切片的10个标本，每组小鼠拍摄100张照片。使用Microsoft Excel的XLSTAT插件对结果进行统计处理。对方差方差分析进行的多途径（年龄、遗传群）分析能够识别差异在第页-值。此外，使用Dunn-Sidak检验进行了多组配对比较，以分析每对之间的差异；第页<0.05被视为显著性阈值。

溶酶体β-半乳糖苷酶的分析。切除后，立即在含有0.25M蔗糖（每7 mL蔗糖1 g组织）的培养基中，在Potter–Elvehjem玻璃均质器中对肝组织进行均质化，该均质器具有特氟隆活塞，按照改良的Marzella和Glaumann方法以200 rpm的速度运行[28]. 通过差速离心分离匀浆。第一次离心是在1000×克用10分钟去除细胞碎片、细胞核和重线粒体。所得上清液以20000×离心克持续20分钟；由此产生的颗粒，即“溶酶体部分”，包含溶酶体（主要成分）、轻线粒体、过氧化物酶体和内质网的混合物。将颗粒悬浮在5 mL 0.1%TRITON X-100中，以释放潜在溶酶体酶。之后，将样品冷冻并储存在−20°C下，直至分析。将样品解冻，转移到1.5 mL Eppendorf试管中，并在12000×克2分钟，清除碎屑和不溶物。根据Barrett方法测定溶酶体组分中β-半乳糖苷酶（BGAL，EC 3.2.1.23）的活性[29]. 蛋白质水平是通过修改Lowry的方法测定的[30]以牛血清白蛋白为标准。酶的活性以每小时每毫克总蛋白的产品微摩尔数表示。使用Spekol 1500 UV/VIS分光光度计（Analityk Jena AG）测量吸光度。使用Microsoft Excel的XLSTAT插件对结果进行统计处理。对方差方差分析进行的多途径（年龄、遗传群）分析能够识别差异在第页-值。此外，使用Dunn-Sidak检验进行了多次成对比较，以分析每对之间的差异；第页<0.05被认为是一个显著性阈值。

血浆生物标志物死亡后立即通过心脏穿刺收集约200-400µL的外周血。将每只动物的血液与3.2%的柠檬酸钠缓冲液混合在1.8 mL微管中（英国牛津Becton Dickinson），并在4750×克在室温下保持10分钟。接下来，立即收集血浆样本并在−70°C下冷冻。使用半自动生化分析仪COBAS INTEGRA进行所有进一步分析^®400多系统（Roche Diagnostics Ltd.，Rotkreuz，瑞士）。所有用于研究主要代谢途径和器官功能的生化血清分析物同时进行，以尽量减少分析变异性。我们分析了血液的选定参数：丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、三酰甘油（TAG）、胆固醇（TCh）；高密度脂蛋白胆固醇（高密度部分）、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酐。所有化学品的代码均按照标准插入设备中（瑞士罗氏诊断有限公司）。使用Microsoft Excel的XLSTAT插件对结果进行统计处理。对Kruskal–Wallis秩检验（ANOVA的一种非参数替代方法）进行的多途径（年龄、遗传群）分析使我们能够识别差异在第页-值。此外，采用Dunn检验进行多组配对比较，以分析每对之间的差异；第页<0.05为显著性阈值。

3.结果

3.1、。肝细胞结构中与年龄相关的变化

采用半薄组织切片，通过光学显微镜分析肝细胞的组织学。成年（即7个月大）野生型小鼠的肝实质细胞结构正常(图1A） 保持多边形形态，细胞边界清晰。肝细胞有一个圆形的泡状细胞核，细胞质中很少有脂滴。在老年动物（即17个月大的动物）中未观察到肝脏结构的显著变化，仅观察到脂滴数量略有增加(图1C和图2)。成人ApoE^−/−小鼠有典型形态的肝组织(图1B） ●●●●。然而，成年野生型和ApoE之间存在一些差异^−/−可以观察到，因为后者的脂肪变性更严重(图2)。此外，老年人ApoE的肝细胞^−/−与年轻动物相比，小白鼠的细胞质、泡状细胞核、透明细胞系数量适中，脂肪滴数量增加(图1D和图2)。此外，老年人ApoE肝细胞中观察到的脂质沉积数量^−/−小鼠明显高于两个年轻ApoE的肝细胞^−/−小鼠与老年野生型小鼠(图2).

成年野生型动物的肝细胞具有细胞核、核仁、线粒体、内质网和溶酶体的“正常”超微结构（典型的显微照片见图3A） ●●●●。相反，在老年小鼠肝细胞中，观察到许多线粒体受损，嵴断裂，基质空泡化，初级溶酶体增多(图3C、 H、I和图4A） ●●●●。与成年野生型动物肝细胞相比，老年小鼠肝细胞中受损线粒体的数量增加了三倍(图4B） 但细胞核、核仁和内质网未见明显变化。成人和老年人ApoE超微结构的变化^−/−老鼠更明显(图3B、 D–G）。然而，成年和老年ApoE中线粒体的长度较大^−/−小鼠与野生型小鼠的比较(图4C） ●●●●。此外，在老年ApoE肝细胞中观察到核脂质内含物、脂褐素沉积和胶原纤维^−/−成年ApoE中未发现的小鼠^−/−动物(图3B、 D–G）。

3.2、。年龄相关的心肌细胞结构变化

成年野生型和ApoE心脏的半薄切片^−/−小鼠心肌结构正常。肌细胞呈圆柱形，肌纤维呈平行排列(图5A、 B）。老年野生型小鼠的心脏组织在肌肉纤维之间出现轻微肿胀(图5C） ●●●●。然而，在老年人Apo E中也发现了类似的形态学变化^−/−老鼠(图5D） ●●●●。

成虫野生型和载脂蛋白E的超微结构^−/−小鼠具有可比性。在这两例患者中均观察到具有正常膜和染色质的细胞核，以及肌原纤维之间具有规则嵴排列的线粒体(图6A、 B）。在野生型或ApoE的老年小鼠心肌细胞中观察到线粒体受损，嵴肿胀和断裂，内膜断裂^−/−(图6C–E），与成年动物相比，数量显著增加(图7A） ●●●●。两种菌株的老年动物心肌细胞中线粒体的大小都增加了。然而，ApoE心肌细胞中这种变化的程度更大^−/−老鼠(图7B） ●●●●。两种菌株的老年动物的心肌细胞的核极均发现了脂褐素沉积(图6C、 D）。此外，在老年ApoE的血管中发现了大量含有脂质的泡沫细胞^−/−老鼠。

3.3. 生化标记物的年龄相关变化

在两种毒株的成年和老年小鼠的血液中测试了几种血浆生物标记物(图8)。老年人ApoE血浆ALT活性下降^−/−与成年动物相比，小鼠的血浆浓度明显低于老年野生型动物。此外，ApoE患者血浆中AST和GGT活性水平普遍较低^−/−动物比野生型多。成年和老年ApoE的LDH降低^−/−小鼠与老年野生型小鼠的比较。ApoE血浆中的甘油三酯水平较低^−/−但在一个菌株中没有观察到与年龄相关的差异。另一方面，老年人ApoE血浆中胆固醇和HDL水平升高^−/−小鼠血浆中的水平明显高于老年野生型动物。此外，老年野生型小鼠血浆中的肌酐水平显著升高，而成年或老年ApoE小鼠血浆中肌酐水平持续升高^−/−动物与野生型小鼠的比较。

3.4. 溶酶体β-半乳糖苷酶的分析

此外，对肝匀浆中溶酶体β-半乳糖苷酶的活性进行了分析，结果表明两种小鼠的老年动物的溶酶体酶活性均显著增加(图9).

4.讨论

衰老与肝脏的各种形态学变化有关，但这些变化的机制尚不清楚[31]. 衰老对病理条件下的肝功能、细胞活力和组织再生产生不利影响，其中包括与动脉粥样硬化相关的脂质代谢异常[32]. 随着年龄增长，肝脏出现的任何异常也会反映在心脏功能上[33]. 根据Shah和Sass的工作[26]肝损伤被称为“心脏性肝病”，是可变血流动力学障碍的常见特征，可与急性或慢性心力衰竭相关[34，35，36]. 尽管在这一领域进行了大量研究，但肝脏疾病中细胞衰老的详细机制和生物学功能尚未完全阐明[1，18，37]. 细胞老化没有单一标志物，但其主要特征是多种标志物的组合，如细胞周期抑制剂的表达、β-半乳糖苷酶活性和形态学变化，如肝细胞增大或老年小鼠多倍体肝细胞增多[22，38].

我们的研究结果侧重于评估具有野生型或ApoE缺陷表型的老年（17个月龄）小鼠肝脏和心脏组织的形态学和超微结构变化。在老年ApoE缺陷动物的肝脏中观察到脂质沉积数量显著增加，这表明脂质代谢受损，但在组织形态水平上没有观察到其他显著变化。然而，在肝细胞超微结构水平上观察到一些与衰老相关的特征，这些特征在ApoE缺乏动物中表达更强烈。在两种菌株的老年动物中均观察到线粒体受损数量增加，但在ApoE缺陷小鼠中，与衰老相关的变化更为深刻。值得注意的是，在各种老化细胞中观察到线粒体的数量和质量变化[39，40]. 衰老的线粒体表现出结构退化，如肿胀、嵴丧失，有时内膜完全破坏，从而形成无定形的电子致密物质[41]. 此外，在老年ApoE缺乏动物的肝细胞中发现了脂滴、核脂质内含物、脂褐素和胶原纤维。受损大分子和细胞器的积累是衰老细胞中最持久的变化之一，与不同分解代谢途径的下降有关。然而，我们的超微结构研究并没有证实衰老肝细胞自噬过程的加剧。我们没有观察到自噬液泡和/或次级溶酶体数量的增加，这将证实溶酶体降解过程的增加。发现初级溶酶体数量增加，线粒体附近存在发育良好的粗面内质网，这可能表明细胞正在正确合成蛋白质。然而，与之前的研究一致[25，42，43]老年动物肝细胞中溶酶体数量和溶酶体β-半乳糖苷酶活性增加，但野生型和同龄ApoE缺乏小鼠之间无显著差异。

最显著的年龄相关性变化发生在长寿的有丝分裂后细胞，包括心肌细胞。这些细胞由于其强烈的氧代谢和活性氧的产生，特别容易衰老。心肌病和心力衰竭的发病率随着年龄的增长而逐渐增加[21]. 因此，有人认为，缺陷线粒体的逐渐积累与老年人的心脏功能障碍有关[44]. 心脏病经常影响肝脏，而肝脏疾病影响心脏，这两种影响都可以通过额外的病理环境因素来加速[33]. 因此，被称为“心脏性肝病”的肝损伤是可变血流动力学障碍的常见特征，可能与急性或慢性心力衰竭有关[26]. 我们的超微结构分析显示，老年动物心肌细胞中受损线粒体堆积。此外，在老年ApoE缺乏小鼠的心肌细胞中，线粒体融合增加和/或分裂减少导致其尺寸增大的作用更强。值得注意的是，裂变调节形态，促进线粒体运输，并分离最严重受损的线粒体，以保持线粒体网络的健康[45，46]. 此外，我们的结果并没有显示心肌细胞的自噬，而心肌细胞通常具有细胞保护功能。

在生化水平上，我们发现老年ApoE缺乏小鼠血浆中胆固醇和HDL水平与衰老相关，这与这些动物心脏组织中存在泡沫细胞有关。这一观察结果证实，ApoE的缺乏导致血浆中VLDL（极低密度脂蛋白）和乳糜微粒残留增加，血管中泡沫细胞形成增加，从而导致动脉粥样硬化[47，48]. 已知载脂蛋白E脂质代谢中与年龄相关的主要变化是总胆固醇和甘油三酯增加、脂蛋白谱改变、载脂蛋白E-受体合成和数量减少、脂解酶活性降低以及脂肪酸氧化强度降低^−/−老鼠[48，49]. 我们的观察还表明，高胆固醇血症ApoE的表型^−/−小鼠与肝脏和心脏组织的衰老有关。