简介
转移仍然是前列腺癌相关死亡的主要原因，而前列腺癌是美国男性癌症死亡的第二大原因[1]. 不幸的是，目前没有有效的治疗方法[2,三].
PI3K/Akt通路是CaP进展的主要促因[4,5]. 在42%的原发性CaP病变和100%的转移性肿瘤中，PI3K/Akt通路在一个或多个成分中表现出改变（突变/缺失、拷贝数变化、差异基因表达）[6]. 由于PI3K/Akt通路在促进癌症进展中的关键作用，许多针对该通路的抑制剂被发明并在临床试验中进行了测试[7]. 不幸的是，这些抑制剂的治疗效果仍然有限[8]. 识别调节转移级联的基因将为致命转移性CaP提供新的更有效的治疗方法，并延长CaP患者的生存期。
为了了解CaP转移所必需的遗传成分，我们使用高通量shRNA筛选方法来识别LNCaP原位CaP模型中潜在的转移抑制因子体内通过DNA序列分析和BLAST数据库搜索，我们确定γ-氨基丁酸（GABA）A受体相关蛋白样1（GABARAPL1）为候选转移抑制因子。GABARAPL1，也称为自噬相关8（ATG8）或腺上皮细胞蛋白1（GEC1），属于GABARAP家族[9]. GABARAPL1在蛋白质相互作用和运输、自噬、细胞增殖和肿瘤进展中发挥重要作用[9].
以前，我们在入侵检测中使用这种功能性shRNA筛选方法在体外并将PI3K/Akt失活下游靶点FOXO4确定为潜在的CaP转移抑制因子[10,11]. 有趣的是，几个组显示GABARAPL1的表达受FOXO的调节[12——14]表明GABARAPL1是FOXO的下游目标。此外，最近的一项研究表明，Akt降低了GABARAPL1的表达[15]. 因此，我们假设抗转移GABARAPL1可能参与PI3K/Akt通路。接下来，我们试图确定激活的Akt对LNCaP细胞中FOXOs和GABARAPL1表达以及细胞侵袭的影响。我们的数据强烈表明Akt抑制FOXOs-GABARAPL1信号可能是CaP进展和转移的重要机制。
结果
在LNCaP原位CaP模型中进行全基因组shRNA筛选，确定GABARAPL1是潜在的转移抑制因子
为了更好地了解CaP转移所需的遗传成分，我们使用高通量全基因组shRNA筛选方法来确定LNCaP原位CaP模型中抑制淋巴结转移的基因。A schematic summary of the体内潜在转移抑制基因的shRNA文库筛选见图1A我们的目的是从低侵袭性LNCaP细胞中选择区域淋巴结转移细胞，这些细胞感染了GFP标记的慢病毒编码人类全基因组shRNA文库（约10000 shRNAs）。建立稳定的克隆，并将其原位注射到雄性裸鼠的前列腺中，这些裸鼠的两侧植入了睾酮颗粒。10周后通过生物发光成像仪评估原发肿瘤的生长和盆腔局部淋巴结转移。原发肿瘤和淋巴结转移可见(图1B——1个). 肺部、肝脏和肾脏未观察到转移(图1C). 从淋巴结中分离细胞，并选择耐嘌呤霉素的转移性LNCaP细胞在体外建立单菌落，用条形码和shRNA序列进行PCR测序分析，然后进行BLAST数据库搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)目的是确定这些转移性LNCaP细胞中被shRNAs沉默的基因。这些基因包括GABA（A）受体相关蛋白样1（GABARAPL1）、亮氨酸脯氨酸富集蛋白聚糖（leprecan）1（LEPRE1）、肌球蛋白IIIB（MYO3B）、锌指蛋白763（ZNF763）、tRNA天冬氨酸甲基转移酶1（TRDMT1）、Opoid生长因子受体样1（OGFRL1）和运动障碍易感性1候选基因1（DYX1C1）(表1). 鉴于人们对自噬与癌症进展和转移之间的联系越来越了解[16,17]，我们选择GABARAPL1进一步研究其作为转移抑制因子的潜力。
GABARAPL1在人转移性CaP细胞系和CaP肿瘤组织中下调
转移抑制基因在高转移肿瘤细胞中的表达水平通常低于低转移或非转移肿瘤细胞或正常细胞[18]. 为了检测GABARAPL1的表达模式是否与转移潜能反向相关，我们首先通过qRT-PCR评估了具有不同转移倾向的六种CaP细胞系和永生化人原代前列腺上皮细胞RWPE-1中GABARAP1 mRNA的表达。GABARAPL1在RWPE-1和LNCaP细胞中高表达(图2A). 更重要的是，GABARAPL1的表达与CaP细胞的转移能力呈负相关(图2A). 淋巴结转移变异体LNCaP/LN3和PC-3/LN4与亲代LNCaP和PC-3相比，GABARAPL1的表达显著降低(图2A). 高转移性人CaP细胞系DU145和CWR22Rv1都具有非常低水平的GABARAPL1(图2A). 除LNCaP细胞外，RWPE-1细胞与CaP细胞系之间的差异具有统计学意义(P（P）< 0.001). 此外，Oncomine数据库中的数据挖掘(http://www.oncomine.org)包括4项个人研究表明，与原发肿瘤样本相比，GABARAPL1在转移性CaP中显著下调，正常前列腺组织样本中GABARAP1表达最高(图2B).
为了进一步研究GABARAPL1表达与CaP细胞系转移的反向关系，采用qRT-PCR方法检测了80例CaP肿瘤组织和59例良性前列腺增生（BPH）患者前列腺组织中GABARAP1 mRNA的表达。总的来说，CaP肿瘤组织中GABARAPL1 mRNA的表达水平显著低于良性前列腺组织(P（P）< 0.001) (图2C). 在CaP肿瘤组织中，随着Gleason评分的增加，GABARAPL1逐渐丢失(图2C). 此外，对包括174例CaP病例在内的已发表研究的数据进行分析[6]，在上提供cbio门户网站(http://www.cbioportal.org/public-portal/)结果显示，与142例（82%）GABARAPL1在CaP肿瘤组织中表达水平没有改变的患者相比，32例（18%）CaP肿瘤中GABARAP1表达下调的患者无病时间更短(图2D). 这些数据强烈表明GABARAPL1的丢失与CaP的侵袭性相关。
敲除GABARAPL1促进LNCaP细胞侵袭
为了确定GABARAPL1的下调是否有助于CaP细胞的高转移能力，用两种不同的抗GABARAP1的shRNAs短暂感染LNCaP细胞，并用于评估对细胞运动性和侵袭性的影响。通过Western blot分析验证了GABARAPL1蛋白表达的成功敲除(图3A). 接下来，我们使用划痕“伤口”愈合试验检查GABARAPL1的敲除是否影响LNCaP细胞的运动。LNCaP细胞运动能力差，因此在24小时内，shControl-transfacted LNCaP细胞仅部分覆盖了损伤的缝隙(图3B). 相反，两个shGABARAPL1转染的LNCaP细胞中的任何一个在24小时内几乎覆盖了整个受损区域(图3B)表明GABARAPL1的敲除促进CaP细胞运动。为了进一步检查GABARAPL1在CaP细胞侵袭中的参与，在基于Matrigel的侵袭测定中使用了用shRNA-GABARAPL1感染的LNCaP细胞。shRNA-GABARAPL1感染导致(P（P）与控制shRNA感染相比，LNCaP细胞侵袭性增加(图3C). 相反，野生型GABARAPL1的过度表达导致CWR22Rv1细胞侵袭性降低(图3D). 总之，这些观察结果表明GABARAPL1可能是一种潜在的转移抑制因子。
FOXO缺失下调GABARAPL1并促进LNCaP细胞的侵袭
为了确定FOXO、GABARAPL1和CaP侵袭之间是否存在关系，用siRNA瞬时转染LNCaP细胞以对抗三种FOXO（FOXO1、FOXO3和FOXO4）或干扰对照siRNA，并进行基于Matrigel的侵袭分析。经Western blot分析验证，三种FOXO蛋白被成功敲除(图3E). FOXOs的敲除导致GABARAPL1的表达降低(图3E)LNCaP细胞侵袭性显著增加(P（P）< 0.05) (图3F). 这些数据表明FOXO可能通过调节GABARAPL1的表达来抑制LNCaP细胞的侵袭性。
激活Akt抑制FOXO及其靶基因GABARAPL1并促进CaP侵袭
PI3K/Akt通路是CaP进展的主要促因[4,5]. 当PI3K/Akt途径在CaP细胞中被激活时，Akt直接磷酸化FOXO，导致FOXO失活并滞留在胞浆中[19]. Akt激活还导致GABARAPL1的下调[15]. 因此，我们研究了Akt的激活是否可以通过FOXOs及其靶基因GABARAPL1的失活来促进LNCaP的侵袭性。组成活化Akt（myr-Akt）的表达促进FOXO1和FOXO3的磷酸化，同时降低GABARAPL1的表达(图3G). 此外，组成性激活Akt的表达增加了LNCaP细胞的侵袭性(图3H). 强制表达GABARAPL1减弱myr-Akt增强的LNCaP细胞侵袭性(图3I). 综上所述，这些数据表明Akt的激活抑制FOXO及其靶基因GABARAPL1，并促进CaP入侵。
人CaP肿瘤组织中Akt表达与GABARAPL1表达呈负相关
为了研究Akt和GABARAPL1在临床样本中的表达是否相关，我们通过免疫组织化学染色评估了它们在10对原发性CaP肿瘤组织和匹配的相邻非肿瘤组织中的表达。p-Akt的强染色Ser473系列在CaP肿瘤组织中观察到，而在邻近的非肿瘤组织中未观察到阳性染色(图4A). 相反，在CaP肿瘤组织中观察到极低的GABARAPL1染色，而在邻近的非肿瘤组织中高表达(图4B). 通过IHC染色强度和面积的乘积计算肿瘤组织和邻近非肿瘤组织中GABARAPL1的相对表达组织核心(图4C). 发现Akt和GABARAPL1在CaP肿瘤组织中的表达呈负相关，这表明Akt对GABARAP1的失活，很可能是通过FOXOs，参与了CaP的进展。
讨论
有确凿证据表明PI3K/Akt通路在CaP进展和转移中起关键作用[6]. 因此，许多针对该途径的抑制剂目前正在进行临床试验。然而，PI3K、Akt或mTOR抑制剂的治疗益处不大[8]. 抗雄激素受体抑制剂单独或与PI3K/Akt/mTOR途径抑制剂（如mTOR抑制剂）联合治疗去势耐受性前列腺癌（CRPC）一直令人失望。在最近的一项II期试验中，卡铂和mTOR抑制剂依维莫司联合应用对转移性CRPC的疗效微乎其微[20]. 这些结果表明，其他机制也可能与钙磷转移有关。
Vogelstein的小组提出了一项令人惊讶的发现，在结肠癌小鼠模型中，Akt1和Akt2的基因失活导致肝转移显著减少，这与FOXO蛋白的激活有关，但与众所周知的下游信号靶点GSK3b或mTOR无关[21]. 根据这一发现，我们之前在体外通过阻断PI3K/Akt通路，筛选出FOXO4是一种转移抑制因子[10]. FOXO家族成员FOXO1、FOXO3和FOXO4是广泛表达的转录因子，通过抑制促进增殖、存活或去分化的基因表达发挥肿瘤抑制作用[22,23]. 越来越多的证据支持FOXO成员在CaP中的抗肿瘤作用。例如，FOXO3a的缺失促进TRAMP-CaP小鼠模型中的癌症形成[24]而FOXO蛋白的上调或激活导致CaP细胞生长停滞和凋亡[25——27]. 相反，Akt直接磷酸化FOXO家族成员，从而通过促进FOXO与14-3-3蛋白的结合来对抗FOXO的功能，从而防止其核移位[28]. FOXO的胞浆滞留导致其泛素化介导的蛋白酶体降解[29]. 这些观察结果表明，Akt/FOXOs通路可能与CaP的进展和转移有关。
我们目前的研究通过全基因组shRNA筛查发现GABARAPL1是一种潜在的转移抑制因子，可增加LNCaP淋巴结转移体内越来越多的研究结果表明，GABARAPL1是癌症进展的负调节因子。与正常组织相比，各种癌症组织中GABARAPL1表达降低[30]. GABARAPL1表达水平与乳腺癌患者（尤其是淋巴结阳性患者）较高的组织学分级和较低的转移风险相关[31]. 这些数据表明，尽管GABARAPL1最初被鉴定为自噬相关基因，但它可能作为肿瘤转移抑制因子发挥新的自噬无关作用。
我们的结果进一步表明，沉默FOXO导致LNCaP细胞中GABARAPL1表达降低，侵袭性增加。组分活化Akt（myr-Akt）增加了与FOXO失活相关的LNCaP细胞的侵袭性，并降低了GABARAPL1。事实上，强制表达GABARAPL1部分逆转了LNCaP/myr-Akt细胞的侵袭性增加。
最近，越来越多的工作[32——35]研究表明，自噬促进了转移级联过程中的多个步骤，例如调节上皮-间充质转化（EMT）、肿瘤细胞迁移和侵袭。需要进一步研究来明确GABARAPL1如何通过自噬途径抑制前列腺癌细胞侵袭。毫不奇怪，GABARAPL1抑制的浸润与自噬有关。
总之，我们的在体外和体内RNAi筛选结果强烈表明，Akt介导的FOXO激活抑制及其下游靶点（如GABARAPL1）的表达可促进CaP转移。因此，我们假设Akt对FOXOs-GABARAPL1信号的抑制是CaP进展和转移的重要机制(图5).
材料和方法
抗体和试剂
本研究中使用了以下一级抗体（Ab）：从Abcam（马萨诸塞州剑桥市）购买了对pan-Akt（#ab8805）、p-Akt（Ser473）（#ab81283）、抗GABARAPL1（#ab86503）特异的兔多克隆抗体，以及SP兔HRP试剂盒。抗-FOXO1（#2880）、FOXO3（#12829）、FOXO4（#9472）、对-FOXO（Ser256）（#9461）和对-FOXO3a（Ser253）（#9466）来自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）。小鼠单克隆抗GAPDH和β-肌动蛋白来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。
细胞培养
如前所述，建立了感染DECODE（OpenBiosystems）混合pGIPZ慢病毒文库编码人类shRNAs的人类CaP LNCaP细胞[10]. LNCaP、PC-3、CWR22Rv1、RWPE-1和DU145购自中国细胞库研究院。将RWPE-1、LNCaP、LNCaP/LN3和CWR22Rv1细胞在补充有10%FBS的RPMI 1640培养基中培养，并在37℃下在含有5%CO2的湿润培养箱中孵育。PC-3和PC-3M/LN4细胞在添加10%FBS的DMEM/F12培养基中培养。
临床样本
2013年3月至9月，在华山医院泌尿科和复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科（中国上海）共采集了80份前列腺癌患者的CaP组织样本和59份对照前列腺组织样本。从徐州医学院附属医院（中国江苏徐州）获得了10对原发肿瘤和匹配的相邻非肿瘤组织样本。招募前已获得所有受试者的书面同意。本研究方案经华山医院伦理委员会、复旦大学肿瘤医院和徐州医学院附属医院批准。病理学家通过连续切片的组织学检查，确认所有肿瘤样本中含有80%以上的肿瘤细胞。根据1997年TNM分类对福尔马林固定标本进行病理检查后评估分期。受试者的临床和病理特征已在之前报告过[36].
瞬时转染
pLKO.1-shRNA-GABARAPL1质粒[37]根据制造商的方案，使用Lipofectamine试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）将组成性激活的Akt1（myr-Akt1）或对照载体与pEGFP DNA（Clontech/Takara，Mountainview，CA）瞬时共转染到LNCaP细胞中。pAd-GABARAPL1质粒[37]与pEGFP DNA瞬时共转染到CWR22Rv1细胞。将转染的LNCaP和CWR22Rv1细胞孵育40 h。GFP阳性细胞通过荧光激活细胞分选机进行分选，并用于Western blotting和侵袭分析。
原位CaP转移模型
如前所述，将睾酮颗粒植入6-8周龄雄性裸鼠（每组5只）的两侧[10]. 106如前所述，将感染GFP标记的编码人类基因组shRNAs的慢病毒文库（9750个shRNA克隆/库中的7个库中的13650个靶基因）的LNCaP细胞原位注射到这些雄性裸鼠的前列腺背叶[10]. 10周后，处死小鼠，并使用全身成像检查原发性肿瘤和器官中是否存在GFP荧光（Lightools Research，Encinitas，CA）。收集盆腔淋巴结并用蛋白酶消化。将细胞悬液置于培养皿上，并选择用于耐嘌呤霉素（2μg/ml）转移性LNCaP细胞。所有动物实验方案均由深圳生物化学研究所动物护理和使用委员会批准。
siRNA转染
针对FOXO1、FOXO3或FOXO4的合成ON-TARGETplus SMARTpool siRNA、siCONTROL非特异性siRNA（NS-siRNA）和DharmaFECT-1转染试剂购自Dharmacon（Lafayette，CO）。LNCaP细胞被镀在6孔板（5×104每口井）隔夜。按照制造商的方案，使用DharmaFECT1将50 nM的NS-siRNA或三种FOXO特异性siRNA转染细胞24小时。
免疫印迹（IB）分析
细胞在RIPA缓冲液中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒进行裂解（德国曼海姆罗氏诊断公司）。用SDS-PAGE分离蛋白质样品（40μg），将其印在聚偏氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白（Sigma）在1×TBS/T（0.1%吐温-20，Tris缓冲盐水）中封闭30 min，然后用指示的一级抗体进行探测。使用GeneTools软件对Chemi-Genius2生物成像仪（Syngene，Frederick，MD）进行数字成像和信号量化。
侵入试验
如前所述，进行改良的基于Matrigel的Boyden室分析[38]. 简单地说，用质粒或siRNAs转染的LNCaP或CWR22Rv1细胞被放置在侵入室的插入物中。添加FBS（10%）作为化学引诱剂。培养24小时后，用棉签从插入物中取出未穿透膜的细胞。使用Diff-Quik染色装置（Dade Behring Inc.，Newark，DE）固定和染色腔室，并在明亮视野显微镜下进行检查。计算每个膜（×20个目标）6个区域内的入侵细胞数，并给出三个独立实验的平均值。
免疫组织化学（IHC）和成像
如前所述进行IHC测定[36]. 简单地说，从前列腺切除术后的患者身上获取了10对原发肿瘤和匹配的相邻非肿瘤组织样本，并将其固定在10%的福尔马林缓冲液中，嵌入石蜡中，并在4微米处切片。将载玻片在数个二甲苯浴中脱para化，然后在分级乙醇系列中再水化，然后加入ddH2O。将p-Akt（Ser473）（1:500）和GABARAPL1（1:500。使用奥林巴斯BX53显微镜扫描载玻片，并使用Cellsens Entry（奥林巴斯）观察载玻片。免疫反应性的强度（强度评分）以0-4:0的任意尺度进行判断，为阴性；1、弱；2、中度；3，强壮，4，非常强壮。此外，根据显示每个强度评分的组织面积百分比，对样本进行百分比评分。通过将强度得分和百分比得分相乘，计算每个样本的组织核心。因此，组织核心从0到400不等。
定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）
使用TRIZOL试剂（Sigma）分离总RNA，并使用Revert Aid First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Scientific）将其逆转录成cDNA。使用SYBR预混料EX-Taq（TaKaRa）进行实时PCR，并使用CFX96实时系统（BIO-RAD）进行分析。PCR引物序列如下：GABARAPL1：正向，5′-AGGAGGACCATCCCTTTGAGT-3′；背面为5′-TGGCCAACAGTAAGGTCAGA-3′。β-肌动蛋白：正向，5′-GACCTGACTACTTCATGAAGAT-3′；背面为5′-GTCACCTCTCATGATGGAGTTGAAG G-3′。β-actin被用作qRT-PCR反应的看家基因。每项测试都是在三重复制中进行的-ΔΔCt方法[26]用于计算基因的表达。
统计分析
组间的统计显著性由双尾学生的t吨-测试。采用χ2检验CaP肿瘤组织和前列腺增生组织标本之间基因表达水平的差异。所有统计分析均采用SPSS 16.0软件进行。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
缩写
前列腺癌；去势前列腺癌；γ-氨基丁酸（GABA）A受体相关蛋白样1；ATG8，自噬相关8；GEC1，腺上皮细胞蛋白1；FOXO，FOXO转录因子；良性前列腺增生；LEPRE1，富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖（leprecan）1；肌球蛋白IIIB；ZNF763，锌指蛋白763；TRDMT1，tRNA天冬氨酸甲基转移酶1；OGFRL1，Opoid生长因子受体样1；DYX1C1，运动障碍易感性1候选1；qRT-PCR，实时定量RT-PCR；淋巴结；磷脂酰肌醇-3-激酶；免疫组织化学；myr-Akt1，Akt1激活。EMT，上皮-间质转化。
致谢
我们感谢罗斯韦尔公园癌症研究所（美国纽约州布法罗）的Irwin H.Gelman博士，感谢他用Decode RNAi病毒库和myr-Akt1质粒感染LNCaP前列腺癌细胞系。华山医院（中国上海）的Ming Guan医生负责前列腺癌组织。作者感谢深圳生物医学研究支持平台提供的卓越技术援助。
利益冲突
提交人声明他们没有利益冲突。
给予支持
本研究得到了国家自然科学基金项目81272380（至B.S.）和81572873（至B.S）的支持。
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