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.1999年1月19日;96(2):657-62。
doi:10.1073/pnas.96.2.657。

心肌肌浆网一氧化氮合酶

附属公司

心肌肌浆网一氧化氮合酶

K Y Xu先生等。 美国国家科学院程序. .

摘要

NO是一种调节心脏功能和新陈代谢的自由基。我们报道了一种神经型一氧化氮合酶(NOS)位于心脏肌浆网(SR)膜泡上,SR相关NOS产生的内源性NO抑制SR Ca2+摄取。在存在NOS底物和辅因子的情况下,从分离的兔心脏SR囊泡中观察到L-精氨酸向L-瓜氨酸的钙依赖性生化转化。囊泡产生内源性NO,并通过电子顺磁共振自旋追踪测量检测。免疫电镜显示,心脏SR囊泡使用抗神经元NOS(nNOS)标记,而不是使用抗内皮NOS(eNOS)或抗诱导NOS(iNOS)抗体标记,而骨骼肌SR囊袋没有nNOS免疫反应性。nNOS免疫反应也显示出与人心肌切片共焦显微照片中SR定位一致的模式。Western blotting显示心脏SR NOS大于大脑NOS(160 vs.155 kDa)。在nNOS基因敲除小鼠的心脏SR囊泡中未观察到免疫检测,也未观察到抗nNOS mu抗体,这表明可能存在新的nNOS型亚型。45Ca~(2+)-ATPase催化的心脏SR囊泡对Ca的摄取被心脏SR NOS内源性产生的NO抑制,7-硝基吲哚唑(一种选择性nNOS抑制剂)完全阻止了这种抑制。这些结果表明,心肌nNOS亚型位于心肌细胞的SR上,可能对细胞内Ca2+浓度作出反应,并调节心脏内SR Ca2+离子的主动转运。

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图1
图1
()在分离的心脏SR囊泡中发现NO合成酶活性。通道A:在存在NOS底物和辅因子的情况下进行控制:Ca2+,钙调蛋白,NADPH,FMN,FAD[3H] 精氨酸和BH4; B道:在无囊泡的NOS底物存在下;通道C:煮沸囊泡+NOS底物和辅因子;D车道:没有Ca2+; 车道E:带有EGTA和NOS底物和辅因子;F道:带10μM 7-NI;车道G:具有60μM TRIM;H车道:10 nM AMT;以及车道I:在10 nM AMT存在下的iNOS。这些结果表明SR NOS活性是Ca2+依赖性和对nNOS选择性抑制剂敏感,表明心脏SR囊泡中存在NOS,并且神经型NOS酶活性具有特异性。数据代表六个独立实验的平均值。(b)心脏SR NOS的Western blot分析。通过7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离心脏SR囊泡,并转移到硝酸纤维素。用亲和生物试剂培养抗nNOS抗体(文学士),带有抗nNOSα抗体(硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼硼)和抗nNOSμ抗体(bC公司). 第1列:大鼠脑匀浆;2:小鼠心脏匀浆;3:小鼠心脏SR囊泡;4:nNOS基因敲除小鼠心脏SR小泡;5:兔心脏SR囊泡。所有样品均为每车道30μg(总蛋白)。用抗nNOS和抗αnNOS抗体检测兔和小鼠心脏SR NOS。结果还表明,大鼠大脑NOS和心脏SR NOS的变性分子量分别约为155和160kDa。
图2
图2
NO的EPR谱铁(MGD)存在下心脏SR小泡的形成2在室温下,在各种条件下复合60min。铁(MGD)2仅限(一个); + SOD处于状态一个(B类);+NOS底物和辅因子的混合物B类(C类); + 条件下的心脏囊泡C类(D类); + 7-NI状态D类(E类); 和+d日-囊泡和辅因子存在下的精氨酸(F类)(请参见方法反应组分的最终浓度)。这些结果表明7-NI敏感的内源性NO(三重态光谱)由分离的心脏SR小泡产生。数据来自每种情况下四个类似独立实验中的一个。
图3
图3
()激光扫描共聚焦显微镜在人心室肌冷冻切片上用单克隆抗体进行心肌细胞抗原的免疫荧光定位。(美国汽车协会)nNOS间接免疫荧光标记(IIL)显示线性纵向和横向条纹标记模式;+,K+-ATPase IIL显示了一种明显不同的人体心脏切片肌膜标记模式(aB类); RyR IIL公司(交流电)和SERCA2 IIL(aD公司)具有与NOS IIL相似的标记模式,提示NOS在心肌中的SR定位,而非唯一的肌膜定位;一种无关的抗病毒蛋白单克隆抗体(美国电气公司)与其他初级单克隆抗体的浓度相同,背景荧光水平较低。(b)单一免疫金标记。SR囊泡与特定的一级抗体和与12 nm胶体金结合的二级抗体孵育。在没有初级抗体的情况下控制囊泡(文学士); 带抗eNOS(bB(英国)); 带抗iNOS(bC公司); 和单个囊泡(b数据库)和一组小泡(bE公司)使用反nNOS。电子显微照片显示,只有nNOS广泛分布在心肌SR膜泡表面。双重免疫金标记:Ca2+-ATP酶(6纳米金粒子)和nNOS(12纳米)(bF公司); +,K+-ATP酶(6 nm)和nNOS(12 nm)(bG(英国)); 和磷酸λ(6 nm)和nNOS(12 nm)(bH公司). 每个囊泡代表每种情况下数百个类似的标记或未标记囊泡。结果显示心脏SR-Ca2+-ATP酶和磷蛋白与SR神经元型NOS共存。Na缺乏+,K+-SR囊泡上的ATP酶进一步证明囊泡代表SR而不是肌膜。
图4
图4
内源性NO的作用心脏SR45不同条件下的钙吸收。不含NOS底物、辅因子和SOD的囊泡(一个); −SOD+thapsigargin(B类)(Tg,钙的特异性抑制剂2+-ATP酶);小泡+SOD(C类); + SOD+Tg(D类); 条件C类在NOS底物和辅因子存在下30分钟(E类),或持续60分钟(F类)(23°C时为30分钟,37°C时30分钟);60分钟孵育(与F类)在NOS抑制剂7-NI(10μM)存在下(G公司);d日-精氨酸替代-精氨酸状态F类(H(H)). 数据表示使用0.6 mg/ml心脏SR囊泡的六个独立实验的平均±SD。所有反应混合物中SOD的浓度为300单位/ml。45钙吸收被内源性NO抑制结果表明,心脏NOS调节SR45直接修饰钙的钙吸收2+-内源性NO的ATP酶功能.

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