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.1999年1月1日；13(1):64-75.
doi:10.1101/gad.13.1.64。

新型p300/CBP结合蛋白p35srj在HIF-1反式激活中的功能作用

巴塔查里亚 1, C L米歇尔斯, M K Leung先生, Z P Arany公司, A L Kung公司, D M利文斯顿
附属公司

新型p300/CBP结合蛋白p35srj在HIF-1反式激活中的功能作用

巴塔查里亚等。 基因开发. .

摘要

低氧诱导因子HIF-1对p300/CBP的招募对于低氧转录反应至关重要，并且需要p300/CPP CH1区域和HIF-1α之间的相互作用。一种新的p300-CH1相互作用蛋白p35srj已被鉴定和克隆。p35srj是一种功能未知的人类蛋白MRG1的选择性剪接亚型。实际上，体内所有内源性p35srj都与p300/CBP结合，它通过阻断HIF-1α/p300 CH1相互作用来抑制HIF-1转录激活。p35srj不影响CH1区外结合p300/CBP的转录因子的反式激活。HIF-1激活剂缺氧或去铁胺显著上调内源性p35srj，提示其可能在负反馈回路中工作。与这个概念一致，p300 CH1突变域在HIF-1中有缺陷，但不与p35srj结合，增强了内源性HIF-1功能。在缺氧细胞中，p35srj可能通过控制HIF-1α对p300/CBP的访问来调节HIF-1反式激活，并可能通过部分隔离和功能分区细胞p300/CPP来保持p300/CBP的很大一部分可用于与其他转录因子的相互作用。

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数字

图1
图1
p35srj的克隆、表达和稳定性(A类)p300和CBP包含多个保守区域。这些区域包括三个富含半胱氨酸-组氨酸的区域（CH1-3）、KIX结构域（结合CREB）、一个溴代多巴胺和一个富含谷氨酰胺的区域。p300–CH1结构域与含有蛋白激酶a磷酸化位点的GST融合，用32P和用作探针克隆p35srj(B类)p35srj肽序列及其同源性。富含丝氨酸-甘氨酸的连接在小鼠p35srj中保守，并被装箱。最小p300结合域（见图3）下划线。FG079M18bg6是来自河豚基因组计划，通过数据库搜索检测。MSG1公司是一种同源的人类基因，也是通过数据库搜索确定的。(C类)p35srj的表达反映了用人类组织进行多人组织Northern印迹（Clontech）检测的结果第35srj页cDNA。(D类)在指数生长的C2C12细胞中，通过脉冲相位分析分析p35srj的稳定性。35在指定的时间点，S标记的p35srj被免疫沉淀。
图2
图2
p35srj是与p300/CBP结合的核蛋白。(A类)内源性p35srj的细胞定位。U2-OS细胞用Hoechst染色以显示细胞核，用抗p35srj单克隆抗体JA22染色以显示内源性p25srj(B类)U2-OS细胞转染HA–p35srj，细胞核Hoechst染色，抗HA单克隆抗体免疫染色。(C类)内源性p35srj与p300的克隆化。用HA–p300转染U2-OS细胞，并用抗HA多克隆抗体染色，以揭示p300过度产生细胞的典型p300点状结构特征。这些细胞与抗p35srj单克隆抗体JA22同时反应，以显示内源性p35srj在p300点中的共定位。合并后的曝光确认了这些点的共同定位。(D类)内源性p35srj与抗p300/CBP抗体联合免疫沉淀的效率。U2-OS细胞裂解物免疫沉淀物（IP）的抗p35srj蛋白印迹。用p35srj（JA22，lane）单克隆抗体进行免疫沉淀1)，对照抗体（PAB419和兔抗鼠IgG，αMIG，车道2,3)和p300/CBP抗体（AC240）（车道4,5). AC240hs免疫沉淀（lane4)在300米内进行米氯化钠。用JA22（lanes）重新沉淀上述免疫沉淀物的上清液6–10)评估游离p35srj的相对水平(E类)U2-OS细胞裂解物免疫沉淀物（IP）的抗p300/CBP免疫印迹。
图3
图3
p35srj羧基末端残基是CH1结合所必需的。(A类)的绑定35S标记的体外翻译p35srj衍生物到GST或GST–p300CH1融合蛋白（通道1–6). 20%的体外翻译输入被加载到车道中7–9. (B类)p35srj羧基末端的指示残基融合到绿色荧光蛋白（GFP）作为载体，合成为35体外翻译S-标记肽（lanes1–4)和进行了结合GST或GST–p300CH1（车道5–12). (C类)p35srj 224–255肽对p35srj与p300–CH1体外结合的影响。(顶部)的绑定35在p35srj肽（20μg，lane4)并与对照肽（20μg，lane）进行比较5)或无肽（lane三). 车道1显示了20%的体外翻译输入。(底部)凝胶考马斯染色显示GST和GST–p300CH1蛋白的相对量。(D类)用3×E2–荧光素酶报告子（50 ng）、E2–p300（20 ng）转染的U2-OS细胞进行哺乳动物双杂交分析，表达载体编码融合到VP16（25 ng）的指示p35srj衍生物，以及CMV–lacZ公司（50纳克）。显示了重复进行的代表性实验的结果。E2–p300包含BPV E2的DNA结合域，与p300融合。
图4
图4
p35srj在体外和体内与HIF-1α竞争结合p300–CH1。(A类)杆状病毒p35srj对HIF-1α与p300–CH1体外结合的影响。(顶部)的绑定35标有S的HIF-1α（车道1)通过体外转化为细菌产生的GST（lane2)或GST–p300CH1（车道三)测试了谷胱甘肽-Sepharose珠固定化。HIF-1α与GST–p300CH1的结合也在杆状病毒表达的野生型（lane4)或突变型p35srj（表达p35srj残基1–160）作为对照（lane5). (底部)凝胶考马斯染色显示GST和GST–p300CH1蛋白的相对量。(B类)SF21细胞裂解物的抗p35srj蛋白印迹A类. (C类)p35srj 224–255肽对HIF-1α与p300–CH1体外结合的影响。(顶部)在野生型肽（lanes）浓度增加的情况下，测试HIF-1α与GST–p300CH1的结合5–8)与对照组或无关肽（lane4)或无肽（lane三).使用的肽量以微克为单位。20%的HIF-1α输入在车道上加载1. (底部)凝胶考马斯染色显示GST和GST–p300CH1蛋白的相对量。(D类)DFO对GAL4–CH1和VP16–HIF1α723–826之间哺乳动物双杂交相互作用的影响(左边)或VP16–p35srj(正确的). 用指示的GAL4和VP16融合质粒（各40 ng）、3×GAL4-luc报告基因（100 ng）和CMV–lacZ公司（100纳克）。GAL4–CH1含有300–528个p300残基。GAL4–CH1Δ缺乏p300残基346–410，作为对照。结果以相对荧光素酶单位（RLU，三个独立实验的平均值）表示 ± s.e.m.公司。). (E类)p35srj对GAL4–p300CH1和VP16–HIF1α双杂交相互作用的影响。Hep3B细胞与VP16HIF1α和GAL4–CH1（各40 ng）以及载体控制或p35srj表达质粒（各80 ng）共转染，并且CMV–lacZ公司（100纳克）。p35srjΔ缺少215–270个残基。结果（三个独立实验的平均值 ± s.e.m.公司。)显示为DFO对荧光素酶活性的折叠诱导。折叠归纳法为1表示没有归纳法。
图5
图5
p35srj通过特异性影响CH1功能来抑制HIF-1反式激活。(A类)p35srj对GAL4-HIF-1α激活GAL4-荧光素酶报告子的影响（723-826）。(顶部)Hep3B细胞与3×GAL4-luc报告基因（0.2μg）、指示的GAL4-HIF1α（0.2μg/）和HA–p35srj表达质粒（0.2μg/）瞬时共转染CMV–lacZ公司（0.1微克）。GAL4–HIF1αΔ缺少HIF-1α的羧基末端13残基。结果以RLU表示。在三个独立的实验中，发现的差异具有统计学意义。(中部；底部)分别用抗GAL4抗体和抗HA抗体通过Western blotting检测上述细胞裂解液中GAL4–HIF1α和HA标记的p35srj蛋白的水平。p35srjΔ突变删除残基215–270，即p300–CH1结合域。(B类)HIF-1α羧基末端突变对其与p300–CH1结合的影响。35通过体外翻译产生由指示的GAL4–HIF-1α质粒编码的S标记蛋白，并且它们能够结合GST–p300CH1（通道3,6)或GST（作为控制，车道2,5)已进行化验。在每种情况下（车道），20%的体外翻译输入被加载为控制1,4). (C类)p35srj对a激活的影响血管内皮生长因子启动子–DFO荧光素酶报告子。Hep3B细胞与VEGF–luc报告基因（40 ng）、p35srj表达质粒（每个300 ng）和CMV–lacZ公司（100纳克）。结果显示为RLU（三个独立实验的平均值 ± s.e.m.公司。). (D类)p35srj对HIF-1α、SREBP2和src1转录激活的影响。将指示的GAL4融合蛋白（2 ng）与p35srj表达质粒（4 ng）、GAL4–luc报告基因（0.1μg）和CMV–lacZ公司（0.2μg）注入Hep3B细胞。结果显示为RLU，代表了几个独立的实验。(E类)p35srj对STAT2和src1反式激活的影响。将指示的GAL4融合蛋白（2 ng）与p35srj表达质粒或载体对照（10 ng）、GAL4–luc报告蛋白（0.1μg）和CMV–lacZ公司（0.3μg）注入U2-OS细胞。结果以相对荧光素酶单位表示（四个独立实验的平均值 ± s.e.m.公司。).
图6
图6
p35srj是由去铁胺和缺氧诱导的。(A类)Hep3B细胞生长汇合并暴露于1%或21%的O2持续6小时或达到100μ米指定时间段的DFO。对来自这些细胞的总RNA进行Northern印迹并探测p35srj(顶部). 28S和18S rRNA被显示为负载对照。使用JA22单克隆抗体（α-p35srj）对这些细胞的全细胞裂解物（每车道50μg）进行Western blot检测p35srj。用抗p300/CBP单克隆抗体、AC240（α-p300/CBP IP）免疫沉淀细胞裂解物，用抗p300/CBP单抗（α-p300/CBP）和抗p35srj单克隆抗体JA22（α-p35srj，底部). (B类)Hep3B细胞生长汇合并暴露于100μ米DFO 5小时。来自对照组的细胞裂解物(C类)细胞或DFO处理(D类)用抗p35srj单克隆抗体JA22（lanes）免疫沉淀细胞三和4），并用抗p300/CBP单克隆抗体进行Western印迹。用于每次免疫沉淀的细胞裂解液总量的四分之一装在车道上1和2分别是。(C类)DFO对第35srj页发起人。Hep3B细胞转染了指定的人第35srj页启动子-荧光素酶结构体（300ng），和CMV–lacZ公司（100纳克）。−1202/−1159野生型报告质粒包含序列5′-gtgtgc全球通用技术指南gtg目录ggacgtg公司计算机辅助几何变换器acgtg公司cccacc，而−1202/−1159突变体包含突变序列5′-gtgtgcgaaaggtgccataccaggaaagcagctaaagccacc，克隆于TK–荧光素酶上游。野生型HIF-1共识序列以下划线表示。结果显示为RLU（三个独立实验的平均值 ± s.e.m.公司。). (D类)第35srj页该启动子在体外结合HIF-1。凝胶位移分析使用32P标记的双链野生型和突变寡核苷酸探针，来源于第35srj页启动程序（参见B类)，已执行。探针与HIF-1α、ARNT或两种蛋白孵育，这两种蛋白是通过体外翻译产生的。寡核苷酸W18和M18是HIF-1结合的野生型和突变竞争对手，在100倍摩尔过量时引入。
图7
图7
p35srj的Sequestering增强HIF-1反式激活。(A类)GST p300–CH1突变对HIF-1α和p35srj结合的影响。GST–CH1野生型包括p300氨基酸300–528。在GST–CH1–371–6和CH1–413–8中，指示的残基被NAAIRS序列取代。测定体外翻译的HIF-1α或p35srj与野生型和突变型GST-CH1肽结合的相对效率。(B类)突变CH1肽对细胞活化的影响血管内皮生长因子去铁胺启动子。突变体是CH1的NAAIRS取代衍生物（p300残基300–528），如A类Hep3B细胞与VEGF–luc报告基因（40 ng）、指示的HA标记CH1表达质粒（每个300 ng）和CMV–lacZ公司（100纳克）。结果显示为DFO对VEGF报告子相对于未诱导活性的折叠诱导。显示了两个独立的实验。实验中的细胞表示为左边分析密度高于正确的. (C类)模型：p35srj在HIF-1转录激活中的假定作用。
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