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.1998年5月12日;95(10):5474-9.
doi:10.1073/pnas.95.10.5474。

碱性螺旋-环-螺旋-PAS孤儿MOP3与昼夜节律和缺氧因子形成转录活性复合物

附属公司

碱性螺旋-环-螺旋-PAS孤儿MOP3与昼夜节律和缺氧因子形成转录活性复合物

J B霍格内什等。 美国国家科学院程序. .

摘要

我们报道,MOP3是转录调节剂的基本螺旋-环-螺旋(bHLH)-PER-ARNT-SIM(PAS)超家族子集的一般二聚体伴侣。我们证明MOP3与MOP4、CLOCK、缺氧诱导因子1alpha(HIF1alpha)和HIF2alpha相互作用。DNA选择协议显示MOP3-MOP4异二聚体与含CACGTGA的DNA元素结合。瞬时转染实验表明,MOP3-MOP4和MOP3-CLOCK复合物结合COS-1细胞中的该元素,并驱动链接荧光素酶报告基因的转录。我们还推导了MOP3-HIF1α复合物(TACGTGA)的高亲和力DNA结合位点,并使用瞬时转染实验证明MOP3-HIF1α和MOP3-HIF2α异二聚体结合该元件,驱动转录,并对细胞缺氧做出反应。最后,我们发现MOP3 mRNA表达与体内四种潜在伙伴分子中的每一种在许多组织中重叠。

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图1
图1
LexAbHLH-PAS融合蛋白与全长MOP3和ARNT的相互作用小组(上部)LexAbHLHPAS“诱饵”和全长“鱼”的示意图。bHLH和PAS域被装箱。显示PAS域的“A”和“B”重复。显示全长“鱼”的反式激活域。(下部)含有HIF1α、HIF2α、MOP3、MOP4、AHR、ARNT和CLOCK的bHLH-PAS结构域的LexA融合蛋白质粒与含有全长MOP3和ARNT的质粒共表达(参见材料和方法). 在含有1μMβ-萘黄酮(14)的平板上测定LexAAHR相互作用。培养后,5-溴-4-氯-3-吲哚β--进行半乳糖苷覆盖试验,强烈的相互作用,在2小时内变蓝;+,较弱的相互作用,在8小时和一夜之间变蓝;和−,隔夜培养后的负相互作用。实验进行了三次,结果相同。
图2
图2
MOP3-MOP4异二聚体的DNA结合特异性。(A类)MOP3-MOP4异二聚体的共识DNA结合位点体外.MOP3-MOP4复合物结合的十个选定DNA序列用电子盒核心框表示。下面是M34共识。显示了相对于电子盒核心的核苷酸位置。大写字母中的碱基是随机数派生的,而小写字母中的碱是引物派生的。(B类)通过竞争分析证明侧翼区域的特殊性。进行凝胶位移分析,其中双链放射性标记的共有寡核苷酸,GGGACACGTG公司ACCC在存在MOP3、MOP4和10、30或100 ng双链未标记竞争性寡核苷酸的情况下培养。除了最保守的+4“A”被改为A、C、G或T外,未标记的竞争对手的设计与标记的寡核苷酸相同。
图3
图3
MOP3与MOP4或时钟的相互作用。(A类)体外MOP3和MOP4的相互作用。在存在未编程的网织红细胞裂解物、MOP3、MOP4和这两种蛋白的情况下,使用放射性标记的一致响应元件M34进行凝胶位移分析。使用一微克纯化的IgG、纯化的MOP3特异性抗体(MOP3Ab)或纯化的MOP4特异性抗体(MOP4Ab)来证明复合物的特异性。(B类)体内MOP3与MOP4或CLOCK的相互作用。(上部)显示了ARNT、MOP3、MOP4和CLOCK的基本区域共识和DNA半位点特异性。被认为与DNA接触的残留物用星号表示。(下部)用M34荧光素酶报告子转染COS-1细胞,每个表达质粒如图所示。转染后20小时收集细胞。荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性进行了标准化,如所述(14)。(插入)对M34响应元件进行了说明,并对核心序列进行了下划线。
图4
图4
MOP3与HIF1α或HIF2α的相互作用。(A类)体外分析MOP3和HIF1α。使用推导出的放射性标记响应元件M13进行凝胶位移分析。所有凝胶位移研究均使用标准化数量的网织红细胞表达的MOP3、HIF1α和ARNT蛋白。为了证明特异性,使用1μg纯化IgG、MOP3特异性(MOP3Ab)或HIF1α特异性抗体(HIF1αAb)。(B类)体内MOP3与HIF1α或HIF2α的相互作用(上部)显示了ARNT、MOP3、HIF1α和HIF2α的基本区域共识和DNA半位点特异性。(下部)用M13荧光素酶报告子转染COS-1细胞,每个表达质粒如图所示。在猿猴病毒40启动子上游克隆了两个含有三个M13元件的寡核苷酸(在元件旁边用2表示)。添加100μM CoCl进行缺氧研究2转染时。转染后20小时收集细胞。□, 相对荧光素酶水平;▪, CoCl存在下的相对荧光素酶水平2. (插入)对M13响应元件进行了说明,并对核心序列进行了下划线。
图5
图5
MOP3和MOP4在小鼠中的表达。(A类)不同小鼠组织中MOP3和MOP4的RPA分析。分析来自全胚胎(胚胎第9.5天(E9.5)、E13.5、E17.5)、胎盘、新生儿肝脏、肾脏、心脏、肺、胸腺、骨骼肌、大脑和成人肝、肾脏、心、肺、胸、骨骼肌和大脑的总RNA(10μg)的MOP3和MOP4表达。对结果进行定量并以相对单位表示。(插入)显示了MOP3和MOP4探针(通道1)、tRNA控制(通道2)和受保护片段(通道3)。(B类)现场MOP3 mRNA分析就地在E15.5胚胎、成人眼、胸腺和结肠的横断脑切片上进行杂交。用来自HIF1α、MOP3和MOP4的反义探针探测载玻片,并在相同条件下拍照。图中显示了E15.5横胚和成人眼睛平行切片的苏木精和伊红染色。横切面:ca,脑导水管;T、 丘脑;lv,侧脑室;3v,第三脑室;st,纹状体。眼睛:pr,视网膜色素;或视网膜外层;ir,视网膜内层;le,晶状体上皮;co,角膜。

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