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.2022年7月14日；27(1):55.
doi:10.1186/s11658-022-00349-1。

METTL3通过以m6A依赖性方式加速miR-221/222前体成熟介导Ang-II诱导的心肌肥大

Rui Zhang（张瑞） 1, 阳阳区 1, 纪振军 1, 郝春树 1, 苏亚敏 1, 姚玉玉 1, 左文杰 1, 席晨 1, 杨明明 1, 马根山 2
附属公司

METTL3通过以m6A依赖性方式加速miR-221/222前体成熟介导Ang-II诱导的心肌肥大

Rui Zhang（张瑞）等。 细胞分子生物学实验. .

摘要

背景：METTL3是m6A中的核心催化酶，与多种心血管疾病有关。然而，METTL3在血管紧张素II（Ang-II）诱导的心肌肥厚中是否以及如何发挥作用尚不清楚。

方法：新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和C57BL/6J小鼠用Ang-II诱导心肌肥厚。qRT-PCR和western blots检测RNA和蛋白质的表达。基因功能分别通过敲除和/或过度表达进行验证。荧光素酶和RNA免疫沉淀（RIP）分析用于验证多个基因之间的相互作用。用小麦胚芽凝集素（WGA）、苏木精-伊红（H&E）和免疫荧光检测心肌大小。用比色试剂盒检测m6A甲基化。

结果：在Ang-II刺激下，METTL3和miR-221/222的表达和m6A水平显著增加。敲除METTL3或miR-221/222可以完全消除NRCM肥大的能力。METTL3对miR-221/222的表达进行了正调控，而结合DGCR8或形成m6A甲基化的pri-miR-221/222水平则被METTL4促进。miR-221/222过度表达可对抗METTL3敲低对肥大的影响。从机制上讲，Wnt/β-catenin信号在肥大过程中被激活，并被METTL3或miR-221/222抑制所抑制。miR-221/222直接靶向Wnt/β-catenin拮抗剂DKK2，抑制DKK2后，miR-221/2抑制剂对Wnt/。最后，AAV9介导的心脏METTL3敲除能够减轻Ang-II诱导的小鼠心肌肥厚模型。

结论：我们的研究结果表明，METTL3以m6A依赖的方式积极调节前miR221/222成熟过程，随后通过抑制DKK2激活Wnt/β-catenin信号，从而促进Ang-II诱导的心肌肥大。AAV9介导的心脏METTL3基因敲除可能是病理性心肌肥厚的治疗方法。

关键词：血管紧张素Ⅱ；心脏肥大；METTL3；Wnt/β-catenin信号；miR-221/222。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
血管紧张素Ⅱ诱导肥厚心肌METTL3表达上调。A类用Ang-II治疗NRCMs以诱导肥大。绿色α-肌动蛋白染色的NRCMs的代表性免疫组织化学图像。细胞核被染成蓝色。比例尺，10μm。评估细胞表面积。n个 = 三。B类qRT-PCR检测Ang-II刺激的NRCM中肥大生物标志物ANP和BNP的表达。n个 = 三。C类Western blot检测Ang-II刺激的NRCM中肥大生物标志物ANP和BNP的表达。n个 = 三。D类qRT-PCR检测血管紧张素Ⅱ诱导的体外心肌肥厚中METTL3的表达。n个 = 三。E类Western印迹检测METTL3在体外Ang II诱导的心肌肥大中的表达。n个 = 三。F类检测发现Ang-II诱导的NRCMs总RNA的m6A修饰。n个 = 三。G公司典型的心脏大体形态。通过心脏重量除以体重计算HW:BW比率。n个 = 5H（H）Western blot检测Ang-II治疗小鼠心肌中METTL3的表达。n个 = 5*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图2
图2
敲除METTL3表达抑制Ang-II诱导的心肌细胞肥大。A类qRT-PCR检测转染shMETTL3的Ang-II诱导的NRCMs中METTL_3的表达。n个 = 三。B类Western blot检测转染shMETTL3的Ang-II诱导的NRCMs中METTL3.的表达。n个 = 三。C类检测发现转染shMETTL3的Ang-II诱导的NRCMs中总RNA的m6A修饰。n个 = 三。D类qRT-PCR检测转染shMETTL3的Ang-II诱导的NRCMs中生物标志物ANP和BNP的表达。n个 = 三。E类Western blot检测转染shMETTL3的Ang-II诱导的NRCMs中生物标志物ANP和BNP的表达。n个 = 三。F类用shMETTL3转染NRCM，然后刺激Ang-II。绿色α-肌动蛋白染色的NRCMs的代表性免疫组织化学图像。细胞核被染成蓝色。比例尺代表10μm。评估细胞表面积。n个 = 3. *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图3
图3
METTL3以m6A依赖的方式促进miR-221/222的成熟。A类qRT-PCR检测血管紧张素Ⅱ诱导的NRCM中miR-221和miR-222的表达。n个 = 三。B类qRT-PCR检测血管紧张素Ⅱ诱导的NRCMs中pri-miR-221和pri-miR222的表达。n个 = 三。C类将plvx-METTL3或shMETTL3.转染NRCMs后，METTL3-分别过度表达和抑制。qRT-PCR检测miR-221和miR-222的表达。n个 = 三。D类通过免疫沉淀实验检测对照组和METTL3过表达NRCMs中与DGCR8或m6A修饰结合的pri-miR-221。n个 = 三。E类通过免疫沉淀实验检测对照组和METTL3过表达NRCMs中与DGCR8或m6A修饰结合的pri-miR-222。n个 = 3. *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图4
图4
miR-221/222介导METTL3对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的调节。A类在血管紧张素Ⅱ诱导的肥大过程中，NRCM中的miR-221和miR-222被特异性抑制剂抑制。绿色α-肌动蛋白染色的NRCMs的代表性免疫组织化学图像。细胞核染上蓝色。比例尺，10μm。评估细胞表面积。n个 = 三。B类qRT-PCR检测转染miR-221/222抑制剂的Ang-II诱导的NRCMs中肥大生物标志物ANP和BNP的表达。n个 = 三。C类Western blot检测转染miR-221/222抑制剂的Ang-II诱导的NRCMs中肥大生物标志物ANP和BNP的表达。n个 = 三。D类将miR-221模拟物和miR-222模拟物转导为METTL3敲低的NRCM，并用Ang II刺激。绿色α-肌动蛋白染色的NRCMs的代表性免疫组织化学图像。细胞核被染成蓝色。比例尺，10μm。评估细胞表面积。n个 = 三。E类qRT-PCR检测转染shMETTL3和miR-221/222模拟物的Ang-II诱导的NRCMs中生物标记物ANP和BNP的表达。n个 = 三。F类Western blot检测转染shMETTL3和miR-221/222模拟物的Ang-II诱导的NRCMs中生物标记物ANP和BNP的表达。n个 = 3. *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图5
图5
Wnt/β‐catenin受METTL3和miR-221/222下游调节。A类维恩图显示了miR-221/222在人类、大鼠和小鼠中的靶点。B类三个物种289个交叉目标基因的KEGG分析。C类三个物种289个交叉靶基因的GO分析。D类Western blot检测Ang-II刺激的NRCMs中β-catenin和c-Myc的表达。n个 = 三。E类qRT-PCR检测Ang-II刺激的NRCMs中c-Myc的表达。n个 = 三。F类Western blot检测METTL3敲除Ang-II诱导的NRCMs中β-catenin和c-Myc的表达。n个 = 三。G公司qRT-PCR检测METTL3敲除Ang-II诱导的NRCM中c-Myc的表达。n个 = 三。H（H）Western blot检测β‐catenin和c-Myc在抑制miR-221/222的Ang-II诱导的NRCMs中的表达。n个 = 三。我qRT-PCR检测c-Myc在血管紧张素Ⅱ诱导的NRCMs中的表达，miR-221/222被抑制。n个 = 3. *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图6
图6
DKK2是miR-221/222调节NRCM Wnt信号的直接靶点。A类TargetScan数据库预测DKK2的3′-UTR中的miR-221/222结合位点。B类qRT-PCR检测Ang-II刺激的NRCMs中DKK2的表达。n个 = 三。C类Western blot检测Ang-II刺激的NRCMs中DKK2的表达。n个 = 三。D类qRT-PCR检测到用miR-221模拟物和抑制剂转导的NRCM中DKK2的表达。n个 = 三。E类Western blot检测用miR-221模拟物和抑制剂转导的NRCMs中DKK2的表达。n个 = 三。F类qRT-PCR检测用miR-222模拟物和抑制剂转导的NRCM中DKK2的表达。n个 = 三。G公司Western blot检测用miR-222模拟物和抑制剂转导的NRCM中DKK2的表达。n个 = 三。H（H）预测DKK2 mRNA的3′-UTR中的miR-221/222结合位点。双荧光素酶报告分析表明DKK2是miR-221/122的直接靶点。我Western印迹检测到Ang II诱导的NRCM中β-catenin和c-Myc的表达，miR-221/222被抑制，DKK2被敲低。n个 = 三。J型qRT-PCR通过miR-221/222抑制和DKK2敲除检测c-Myc在Ang-II诱导的NRCMs中的表达。n个 = 3. *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图7
图7
携带shMETTL3的AAV9递送系统可减轻小鼠的肥大程度。A类动物研究工作流程。B类Western blot检测转染Ang-II小鼠的AAV9-shMETTL3中METTL_3的表达。n个 = 三。C类qRT-PCR检测了包括ANP和BNP在内的生物标记物在三组心脏的表达。n个 = 4D类心脏彩色多普勒超声评价心脏结构指标，包括LVAWs、LVAWd、EF和FS。n个 = shNC组中为7，n个 = 8英寸Ang-II + shNC组，n个 = Ang-II中的7 + shMETTL3组。E类三组小鼠的典型心脏大体形态。n个 = 5F类用H&E和WGA对三组小鼠的组织切片进行染色。n个 = 5.比例尺，50μm*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图8
图8
整个研究的图形摘要。CMs中的METTL3在Ang-II的作用下上调，促进m6A对pri-miR-221/222的修饰，从而导致miR-221/22表达增加。随后，DKK2被抑制，Wnt/β‐catenin/c-Myc通路被激活，最终促进心肌肥厚
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