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.2022年12月;29(1):1257-1271.
doi:10.1080/10717544.2022.2057617。

外显体传递环VMP1通过靶向miR-524-5p-METTL3/SOX2轴促进非小细胞肺癌的进展和顺铂耐药

附属公司

外显子传递的circVMP1通过靶向miR-524-5p-METTL3/SOX2轴促进非小细胞肺癌的进展和顺铂耐药性

谢洪雅等。 药物递送. 2022年12月.

摘要

背景:环状RNA(circRNAs)在包括非小细胞肺癌(NSCLC)在内的多种人类恶性肿瘤中发挥着重要的调节作用。在这里,我们探讨了circRNA空泡膜蛋白1(circVMP1)在非小细胞肺癌进展和顺铂(DDP)耐药中的作用。

方法:采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)法、成球法、伤口愈合法、Transwell法和流式细胞术分析NSCLC细胞的DDP耐药性、增殖、成球能力、迁移、侵袭和凋亡。采用甲基化RIP-qPCR(MeRIP-qPCR)分析mRNA的表达6SRY-box转录因子2(SOX2)的修饰水平。进行双荧光素酶报告物分析、RNA免疫沉淀(RIP)分析和RNA下拉分析以确认分子间相互作用。外显子通过透射电子显微镜(TEM)进行鉴定,并通过纳米颗粒追踪分析(NTA)进行表征。

结果:与亲代细胞系相比,DDP耐药NSCLC细胞系中CircVMP1的表达显著升高。CircVMP1缺失抑制DDP耐药NSCLC细胞的增殖、成球、迁移、侵袭和DDP耐药,并促进其凋亡。CircVMP1作为microRNA-524-5p(miR-524-5p)海绵,上调甲基转移酶3、N6-腺苷-甲基转移酶复合物催化亚基(METTL3)和SOX2的表达。CircVMP1沉默通过靶向miR-524-5p抑制A549/DDP和H1299/DDP细胞的恶性行为和DDP耐药性。外周体VMP1对DDP敏感细胞的恶性特性和DDP耐药性具有传播性。外周体VMP1提高异种移植瘤对DDP的耐药性体内与DDP敏感患者相比,DDP耐药非小细胞肺癌患者的血清样本中外显子环VMP1上调。

结论:外显子介导的circVMP1传递通过靶向miR-524-5p-METTL3/SOX2轴促进NSCLC进展和DDP抵抗。亮点与DDP敏感细胞系相比,DDP耐药NSCLC细胞系中ircVMP1水平上调。CircVMP1缺失抑制A549/DDP和H1299/DDP细胞的恶性行为和DDP耐药性。CircVMP1-miR-524-5p/METTL3/SOX2轴首次识别。CircVMP1通过靶向A549/DDP和H1299/DDP细胞中的miR-524-5p-METTL3/SOX2轴而发挥致癌作用。外周体环VMP1向DDP敏感细胞传递恶性特性和DDP耐药性。

关键词:METTL3;SOX2;循环VMP1;顺铂;外体;miR-524-5p。

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利益冲突声明

提交人没有报告任何潜在的利益冲突。

数字

图1。
图1。
在DDP耐药的NSCLC细胞中,CircVMP1表达上调。建立(A和B)A549/DDP细胞系,采用CCK8法分析A549/DPP细胞系和亲本A549细胞系的DDP耐药性。建立(C和D)H1299/DDP细胞系,用CCK8法测定H1299/DDP和亲本H1299细胞系中DDP的IC50值。(E和F)通过RT-qPCR检测circVMP1在DDP耐药的NSCLC细胞系(A549/DDP和H1299/DDP)和亲本细胞系(C549和H1299)中的表达。(G) circVMP1的基因组位置和剪接模式示意图。通过Sanger测序验证了反向拼接位点。(H) 用发散性引物证实circVMP1的环状结构。(I和J)分析circVMP1的RNase R抗性,并以线性β-actin水平作为对照。(K和L)分析了circVMP1的亚细胞分布,以及U6和18s rRNA被用作细胞核和细胞质的内部参照物。(M和N)通过RT-qPCR分析sh-circVMP1在A549/DDP和H1299/DDP细胞中的转染效率**第页 < .01, ***第页 < .1
图2。
图2。
CircVMP1缺失可抑制NSCLC细胞的增殖、球体形成、迁移、侵袭和DDP抵抗,并诱导其凋亡。用sh-NC或sh-circVMP1瞬时转染(A–H)A549/DDP和H1299/DDP细胞。(A) EdU分析转染A549/DDP和H1299细胞的DNA合成速率,以评估细胞增殖能力。(B) 球体形成试验用于评估转染NSCLC细胞的球体形成效率,以评估细胞干度。(C) 通过伤口愈合实验分析转染NSCLC细胞的迁移能力。(D) 采用Transwell法分析转染NSCLC细胞的侵袭能力。(E) 流式细胞术检测转染NSCLC细胞的凋亡率。(F) CCK8分析转染A549/DDP和H1299/DDP细胞中DDP的IC50值。(G和H)Western blot分析用于测量转染NSCLC细胞中增殖相关指标(c-myc)和EMT相关指标(N-cadherin和vimentin)的蛋白水平**第页 < .01, ***第页 < .1
图3。
图3。
CircVMP1沉默降低了非小细胞肺癌细胞中METTL3和SOX2的蛋白表达。(A和B)Western blot检测METTL3和SOX2在DDP耐药的NSCLC细胞系(A549/DDP和H1299/DDP)和亲本NSCLC(A549和H1299)中的蛋白表达。(C) 采用MeRIP-qPCR分析6A549和A549/DDP细胞株中SOX2的修饰水平。(D) m6采用MeRIP-qPCR检测H1299和H1299/DDP细胞株中SOX2的修饰水平。(E和F)Western blot分析转染sh-NC或sh-METTL3的A549/DDP和H1299/DDP细胞中METTL3和SOX2的蛋白水平。(G) 采用MeRIP-qPCR分析6用sh-NC或sh-METTL3转染的A549/DDP和H1299/DDP细胞中SOX2的修饰水平。(H和I)转录抑制剂放线菌素D用于分析转染sh-NC或sh-METTL3的A549/DDP和H1299/DDP细胞中SOX2 mRNA的稳定性。(J和K)Western blot法检测转染sh-NC或sh-circVMP1的A549/DDP和H11299/DDP细胞中METTL3和SOX2的蛋白水平。(五十) m6用MeRIP-qPCR检测转染sh-NC或sh-circVMP1的A549/DDP和H1299/DDP细胞中SOX2的修饰水平**第页 < .01, ***第页 < .1
图4。
图4。
CircVMP1通过海绵miR-524-5p在NSCLC细胞中正向调节METTL3和SOX2的表达。(A) 利用circBank数据库预测circVMP1的相互作用miRNA,利用starBase数据库预测METTL3和SOX2的相互影响miRNA。维恩图显示了预测的circVMP1、METTL3和SOX2的常见miRNA靶点。(B和C)RIP分析miR-524-5p与circVMP1、METTL3或SOX2之间的相互作用。进行(D和E)RNA下拉分析以确认miR-524-5p与circVMP1、METTL3或SOX2之间的靶向关系。(F) 显示了miR-524-5p与circVMP1、METTL3或SOX2之间的假定结合位点。(G–J)miR-524-5p与circVMP1、METTL3或SOX2之间的相互作用通过双核糖核酸酶报告分析验证。(K) 采用RT-qPCR分析miR-524-5p模拟物在NSCLC细胞中的过表达效率。(五十) 通过RT-qPCR分析抗miR-524-5p在NSCLC细胞中的敲除效率。(M和N)A549/DDP和H1299/DDP细胞转染miR-NC、miR-524-5p、anti-NC或anti-miR-5245p,Western blot检测METTL3和SOX2的蛋白表达。(O和P)在转染sh-NC的A549/DDP和H1299/DDP细胞中测定METTL3和SOX2的蛋白水平 + 防NC,sh-circVMP1 + 反NC或sh-circVMP1 + Western blot检测抗miR-524-5p。(Q) m6sh-NC转染A549/DDP和H1299/DDP细胞中SOX2的修饰水平 + 防NC,sh-circVMP1 + 反NC或sh-circVMP1 + 采用MeRIP-qPCR分析抗miR-524-5p*第页 < .05中**第页 < .01, ***第页 < .1
图5。
图5。
CircVMP1缺失通过上调miR-524-5p部分抑制DDP耐药NSCLC细胞的恶性行为和化疗耐药。用sh-NC转染(A–H)A549/DDP和H1299/DDP细胞 + 防NC,sh-circVMP1 + 反NC或sh-circVMP1 + 抗miR-524-5p。(A) EdU法检测细胞增殖能力。(B) 用成球实验分析NSCLC细胞的成球效率。(C和D)创伤愈合实验和穿孔实验评估NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。(E) 流式细胞术检测NSCLC细胞凋亡率。(F) 采用CCK8分析转染NSCLC细胞中DDP的I550值。(G和H)通过Western blot检测转染NSCLC细胞中c-myc、N-钙粘蛋白和波形蛋白的蛋白水平*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .1
图6。
图6。
DDP耐药的NSCLC细胞通过外泌体将circVMP1传递给亲本NSCLC。(A) TEM扫描显示来自A549、A549/DDP、H1299和H1299/DDP细胞的外泌体图像。(B) NTA揭示了A549、A549/DDP、H1299和H1299/DDP细胞释放的外泌体的大小分布。(C) Western blot检测外体标记蛋白(TSG101、CD63和CD81)的表达。采用(D和E)RT-qPCR检测A549、A549/DDP、H1299和H1299/DDP细胞释放的外体环VMP1的表达。(F) A549和H1299细胞与DIO染色的外泌体孵育30min,然后用DAPI染色5在荧光显微镜下观察外显子的摄取。(G和H)A549和H1299细胞与来自转染sh-NC或sh-circVMP1的A549/DDP或H1299/DDP细胞的外泌体孵育。RT-qPCR检测受体细胞中circVMP1的水平***第页 < .1
图7。
图7。
外显子介导的circVMP1转移传播化疗耐药。(A–U)将A549和H1299细胞与来源于用sh-NC或sh-circVMP1转染的A549/DDP或H1299/DDP细胞的外泌体孵育。(A和B)用Western blot法测定受体细胞中METTL3和SOX2的蛋白表达。(C和D)MeRIP-qPCR分析6SOX2的修改级别。(E和F)EdU分析评估NSCLC细胞的增殖能力。(G-I)成球实验分析NSCLC细胞的成球效率。(J和K)创伤愈合实验分析NSCLC细胞的迁移能力。(L–N)Transwell分析评估NSCLC细胞的侵袭能力。流式细胞术检测NSCLC细胞凋亡情况。(R和S)通过CCK8法分析NSCLC细胞对DDP的耐药性。采用(T和U)Western blot检测非小细胞肺癌细胞中c-myc、N-钙粘蛋白和波形蛋白的蛋白水平*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .1
图8。
图8。
外周体VMP1提高NSCLC细胞对DDP的耐药性体内所有裸鼠皮下注射A549细胞(2×106). 当肿瘤体积达到约100时毫米3,裸鼠被随机分为三组(n个 = 6). DDP(20mg/kg)每周两次腹腔注射到小鼠体内,外泌体(10μg)来源于转染sh-NC或sh-circVMP1的A549/DDP细胞,每两天向小鼠瘤内注射一次。(A) 每5天监测肿瘤体积作为长度×宽度2×0.5. (B) 第25天处死裸鼠,记录肿瘤重量。(C) 采用RT-qPCR检测三组肿瘤组织中circVMP1的表达。(D) 采用IHC法分析三组肿瘤组织中METTL3和SOX2的蛋白水平。(E) Western blot分析三组肿瘤组织中METTL3和SOX2的蛋白水平*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .1
图9。
图9。
与DDP敏感的非小细胞肺癌患者相比,DDP耐药非小细胞肝癌患者血清外泌体中CircVMP1的表达显著增加。(A) 显示了DDP耐药/敏感非小细胞肺癌患者血清外泌体的TEM图像。(B) NTA揭示了DDP耐药/敏感非小细胞肺癌患者血清外泌体的大小和浓度。(C) 进行蛋白质印迹分析以测量外泌体标记蛋白(TSG101、CD63和CD81)的表达。(D) 采用RT-qPCR方法分析DDP耐药/敏感非小细胞肺癌患者血清外泌体中circVMP1的表达。(E和F)血清外泌体暴露于不同条件下,包括在室温下培养(0、6、12或24h) 低pH值溶液(pH=1)或高pH值溶液3室温下h。用RT-qPCR分析circVMP1的稳定性***第页 < .1
图10。
图10。
CircVMP1通过调节miR-524-5p-METTL3/SOX2轴,促进DDP耐药NSCLC细胞的增殖、球体形成、迁移、侵袭和DDP耐药,并抑制其凋亡。

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