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.2022年2月24日；8(1):81.
doi:10.1038/s41420-022-00866-0。

环状RNA hsa_cir_0001394通过靶向miR-527/UBE2A轴促进肝细胞癌的进展

于燕 1, 于聂 1, 春鹏 1, 福成星 2, 赛光记 2, 刘红 三, 朱传东 4
附属公司

环状RNA hsa_circ_0001394通过靶向miR-527/UBE2A轴促进肝细胞癌进展

于燕等。 细胞死亡发现. .

勘误表in

摘要

环状RNA（circRNAs）被认为是不同癌症进展的重要参与者；然而，circRNAs在肝细胞癌（HCC）中的具体机制尚不清楚。在本研究中，通过RNA-seq分析鉴定出hsa_circ_0001394，并确定hsa_carc_00011394在肝癌标本和细胞系中高度表达。hsa_circ_0001394高表达的患者往往表现出较差的生存率。血浆中hsa_circ_0001394的表达增加与临床病理特征密切相关，包括血管浸润增加和晚期TNM分期，如α-脂肪蛋白（AFP）分析所示。Hsa_circ_0001394促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，而Hsa_circ-0001394的敲除抑制体内HCC肿瘤的发生。此外，机制研究表明miR-527与hsa_circ_0001394呈负相互作用。此外，UBE2A被揭示为miR-527的靶点。总的来说，本研究提示hsa_circ_0001394可能通过调节miR-527/UBE2A通路发挥海绵作用，促进HCC进展。因此，hsa_circ_0001394可能成为肝癌治疗中一个有前景的生物标志物和潜在的治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。肝癌标本和细胞系中hsa_circ_0001394的上调。
A类热图显示了三对肝癌标本（右）和匹配的健康对照（左）之间前5个高表达和低表达的circRNA。B类对应于TBC1D14基因的hsa_cir_0001394的剪接成熟长度为740 通过Sanger测序证实了hsa_circ_0001394的bp和头尾剪接。C类用qRT-PCR检测经RNase R处理或不处理的Hep3B和Huh7细胞中hsa_circ_0001394和TBC1D14 mRNA的表达。D类使用qRT-PCR评估hsa_cir_0001394的主要定位。Hsa_circ_0001394主要位于细胞质中。E类根据qRT-PCR评估50对HCC标本和匹配的癌旁组织中hsa_circ_0001394相对不同的表达水平。hsa_cir_0001394在HCC标本中的表达高于对照标本。根据qRT-PCR，hsa_circ_0001394在肝癌不同临床阶段的表达。hsa_circ_0001394在早期（I–II）肝癌中的表达明显低于晚期（III–IV）肝癌。F类根据qRT-PCR评估六种HCC细胞系（Hep3B、HCCLM3、SMMC7721、MHCC97H、HepG2和Huh7）中hsa_circ_0001394的相对表达，并与正常肝细胞（LO2）中的相对表达进行比较。G公司根据hsa_circ_0001394的表达，将50例肝癌标本分为高、低两组。Kaplan–Meier生存分析表明hsa_circ_0001394高表达组的总体生存率较低(第页 = 0.0319）比hsa_circ_0001394低表达组。所有值均表示为平均值 ± SD来自三个具有类似结果的独立实验。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).
图2
图2。Hsa_circ_0001394在体外促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
A类用qRT-PCR检测Hep3B和Huh7细胞中hsa_circ_0001394过表达和敲除的相对表达。用pcDNA3.1（+）circRNA载体稳定转染Hep3B细胞，构建过表达hsa_circ_0001394（Lv-circ）的过表达系统。Lv-NC作为Lv-cric的对照质粒。用短发夹RNA靶点hsa_circ_0001394（sh-circ）稳定转染Huh7细胞后，构建敲除系统。Sh-NC作为Sh-circ的对照质粒。B类用CCK-8法评估转染Lv-hsa_circ_0001394（Lv-circ）的Hep3B细胞和转染sh-hsa_circ-0001394（sh-circ）的Huh7细胞的生长情况。C类集落形成实验表明，hsa_circ_0001394促进肝癌细胞集落形成活性。D类EdU分析中转染Lv-hsa_circ_0001394（Lv-cir）或sh-hsa_circ-0001394（sh-circ）的HCC细胞与相应对照组的比较。E类通过伤口愈合实验检测hsa_circ_0001394对肝癌细胞迁移能力的影响。F类采用Transwell法测定hsa_circ_0001394对肝癌侵袭能力的影响。用于hsa_circ_0001394过表达的Lv-circ，pcDNA3.1（+）circRNA载体；Lv-NC，Lv-cir阴性对照；sh-circ，短发夹RNA靶向hsa_circ_0001394；sh-NC，sh-circ的阴性对照。所有值均表示为平均值 ± SD来自三个具有类似结果的独立实验。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).
图3
图3。Hsa_circ_0001394是miR-527的海绵。
A类环状RNA相互作用体预测了hsa_cir_0001394和miR-527的3′UTR的潜在结合位点。B类使用特定生物素标记的hsa_circ_0001394探针在Hep3B和Huh7细胞中进行CircRNA下拉实验。hsa_circ_0001394下调了多个miRNAs。通过qRT-PCR检测六种候选miRNA的相对丰度。C类用qRT-PCR检测miR-527在6个肝癌细胞和正常肝细胞中的表达。MiR-527在HCC细胞中下调。在六种HCC细胞系中，Hep3B和Huh7细胞分别表现出最高和最低的miR-527表达。D类使用数据库分析患者的生存概率和miR-527水平之间的关系。miR-527表达较高的HCC患者生存期较长。E类根据qRT-PCR，转染Lv-NC或Lv-circ和sh-NC或sh-circ的肝癌细胞系中miR-527的相对表达水平。F类miR-527与WT（野生型）或MUT（突变型）hsa_circ_0001394的潜在结合位点示意图。G公司评估相对荧光素酶活性，以确认hsa_circ_0001394-MUT、hsa_corc_00011394-WT、miR-NC和miR-527模拟物共转染Hep3B和Huh7细胞后的结合位点。H（H）通过qRT-PCR验证转染hsa_circ_0001394过表达质粒（pcDNA3.1）的Hep3B细胞裂解液中hsa_cicr_0001395探针表达显著上调的下拉效率。寡核苷酸探针用于使hsa_circ_0001394表达水平正常化。我使用Hep3B裂解物进行的hsa_circ_0001394下拉实验中海绵复合物中miR-527的相对水平。与对照探针组相比，qRT-PCR检测到hsa_circ_0001394探针组中miR-527的特异性富集。J型qRT-PCR检测肝癌组织和正常组织中hsa_circ_0001394和miR-527的表达呈负相关。K（K）肝癌组织和匹配的相邻正常组织间miR-527的相对表达水平。MiR-527在HCC组织中下调。所有值均表示为平均值 ± SD来自三个具有类似结果的独立实验。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).
图4
图4。MiR-527抑制HCC进展。
A类根据qRT-PCR，转染miR-527模拟物或相应阴性对照物（miR-NC）和miR-527-抑制剂或相应阴性控制物（inh-NC）的肝癌细胞的相对miR-527.表达。B类CCK-8分析显示，MiR-527显著抑制细胞生长，而MiR-527抑制剂促进肝癌细胞生长。C类MiR-527显著抑制集落形成，而MiR-527抑制剂对集落形成的作用相反。D类EdU分析表明，miR-527显著抑制DNA合成，而miR-526抑制剂对肝癌细胞DNA合成的作用相反。E类伤口愈合试验用于比较转染inh-NC或miR-527抑制剂和miR-NC或miR-527模拟物的Hep3B和Huh7细胞的迁移能力。F类通过Transwell分析测定miR-527对肝癌细胞侵袭能力的影响。MiR-527，MiR-527模拟MiR-527-过表达系统；miR-NC，相对于miR-527模拟物的阴性对照质粒；miR-527抑制剂；inh-NC，miR-527抑制剂的相对控制质粒。所有值均表示为平均值 ± SD来自三个具有类似结果的独立实验。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).
图5
图5。UBE2A是miR-527的直接靶点。
A类使用TargetScan、miRTargetLink和miRDB来预测miR-527的潜在靶mRNA。B类通过qRT-PCR测定转染inh-NC或miR-527抑制剂和miR-NC或miR-527模拟物的Hep3B和Huh7细胞中的相对mRNA表达。直方图显示相对mRNA水平。C类从TGGA数据库中获得374例HCC组织和50例正常样本中UBE2A的表达水平，以及生存可能性与UBE2A在HCC中的表达之间的关系。根据TGGA数据库的分析，UBE2A在HCC组织中显著上调，并且UBE2A高表达的患者总体生存率较低。D类通过TargetScan分析miR-527和UBE2A的3′-UTR之间的潜在结合位点。E类miR-527和UBE2A 3′-UTR WT（野生型）或MUT（突变型）之间互补序列的示意图。F类用相对荧光素酶活性检测miR-NC、miR-527 mimics、UBE2A-MUT和UBE2A-WT共转染Hep3B和Huh7细胞后的结合位点。miR-527模拟物和UBE2A-WT的联合转染显著降低了荧光素酶活性，而miR-527-模拟物和UBE2A-MUT联合转染后的荧光素酶活性没有明显变化。G公司根据qRT-PCR，转染miR-NC、miR-527-mimics、inh-NC和miR-527抑制剂的肝癌细胞系的相对UBE2A水平。用miR-527模拟物转染后UBE2A下调，而用miR-52抑制剂转染导致UBE2A上调。H（H）UBE2A的表达与hsa_circ_0001394以及UBE2A与miR-527的相关性分析。Hsa_circ_0001394与UBE2A呈正相关，miR-527与UBE2A呈负相关。我根据qRT-PCR，肝癌和匹配正常组织之间UBE2A mRNA的相对表达水平。UBE2A在HCC组织中上调。J型通过western blotting评估转染了Lv-NC、Lv-circ、sh-NC、sh-circ、miR-NC、miR-527 mimics、inh-NC和miR-527inhibitors的HCC细胞中UBE2A蛋白水平。用Lv-circRNA转染后，UBE2A蛋白水平升高，但用sh-circRNA转染之后蛋白水平降低。然而，用miR-527模拟物转染后UBE2A蛋白质水平降低，但用miR-52抑制剂转染后蛋白水平升高。所有值均表示为平均值 ± SD来自三个具有类似结果的独立实验。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).
图6
图6。Hsa_circ_0001394通过海绵miR-527调节UBE2A。
Sh-NC、Sh-circ、inh-NC和miR-527抑制剂已被联合转染到肝癌细胞中。A类CCK-8分析表明，下调miR-527可消除hsa_circ_0001394敲低对Huh7细胞增殖的抑制作用。B类miR-527的下调减轻了hsa_circ_0001394敲低诱导的Huh7细胞集落形成抑制。C类敲除miR-527可逆转通过敲除hsa_circ_0001394实现的EdU分析的抑制作用。D类沉默hsa_circ_0001394导致迁移能力下降，miR-527抑制剂逆转了这种情况。E类miR-527抑制剂成功减弱了hsa_circ_0001394沉默介导的Huh7细胞侵袭能力的降低。F类根据western blotting，UBE2A和EMT相关蛋白的相对蛋白表达水平，包括E-cadherin、N-cadherin，vimentin和snail。GAPDH被用作内部控制。hsa_circ_0001394缺陷组的N-cadherin、vimentin和snail蛋白水平较低，而E-cadherin的表达则相反。MiR-527抑制剂减弱了hsa_circ_0001394缺陷诱导的E-cadherin的上调和UBE2A、N-cadherin、vimentin和snail水平的下调。G公司UBE2A的过度表达降低了Hep3B和Huh7细胞中p53的半衰期。用myc对照或myc-UBE2A质粒转染HCC细胞，然后用环己酰亚胺（CHX）处理指定的时间段。用蛋白质印迹分析检测UBE2A和p53的蛋白表达。H（H）用myc对照或myc-UBE2A质粒转染后，用MG132处理HCC细胞6个月 h进行western blot分析。UBE2A的上调导致p53蛋白水平显著降低，而p53蛋白水平被MG132阻断。我在转染miR-NC或miR-527模拟物和si-NC或si-UBE2A（UBE2A沉默）的Huh7细胞中，使用western blot分析测定UBE2A、MDM2、Bcl2、p53和Bax的蛋白表达。GAPDH被用作内部控制。与相应的对照组相比，用miR-527模拟物或si-UBE2A转染Huh7细胞降低了MDM2和Bcl2水平，但增加了p53和Bax水平。利用表达UBE2A的CMV-Myc质粒构建Myc-UBE2A、UBE2A过表达系统；Myc对照，Myc-UBE2A相对对照质粒；si-UBE2A，针对UBE2A的小干扰RNA（siRNAs）；si-NC，si-UBE2A的相对对照质粒。所有值均表示为平均值 ± SD来自三个具有类似结果的独立实验。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).
图7
图7。敲除hsa_circ_0001394抑制体内HCC进展。
A类5对裸鼠皮下注射转染sh-NC或sh-circRNA质粒的Huh7细胞。30之后 第天，对肝癌肿瘤进行解剖并拍照。B类计算小鼠安乐死当天的肿瘤重量。hsa_circ_0001394缺陷组肿瘤重量明显低于对照组。C类每5次记录肿瘤体积 从小鼠接种转染sh-NC或sh-circRNA的Huh7细胞的第二天开始。Hsa_circ_0001394基因敲除与对照组相比降低了肿瘤体积。D类根据qRT-PCR，与对照组相比，Hsa_circ_0001394缺陷组的Hsa_circ-0001394表达下调。E类根据qRT-PCR，与对照组相比，sh-circRNA组的MiR-527上调。F类qRT-PCR测定，hsa_circ_0001394敲除组UBE2A的表达水平显著低于对照组。G公司用western blot分析比较sh-NC裸鼠模型和sh-circRNA模型的UBE2A蛋白水平。Hsa_circ_0001394沉默降低了UBE2A的蛋白水平。H（H）由Huh7细胞形成的异种移植瘤切片苏木精-伊红（HE）染色的代表性图像。免疫组化分析检测肿瘤Ki-67染色。所有值均表示为平均值 ± SD来自三个具有类似结果的独立实验。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).
图8
图8。hsa_circ_0001394/miR-527/UBE2A轴促进HCC增殖、迁移和侵袭。
HCC肝细胞癌。
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