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.2021年6月9日10:e67681。
doi:10.7554/eLife.67681。

注射弓形虫蛋白质影响神经元健康和存活

奥斯卡·A·门德斯 1, 埃米利亚诺·弗洛雷斯·马查多 2, Jing Lu公司 三, 安妮塔·科西 2 4 5
附属公司

注入弓形虫蛋白质影响神经元健康和存活

奥斯卡·A·门德斯等。 埃利夫. .

摘要

弓形虫是一种引起神经元长期潜伏感染的细胞内寄生虫。使用一个基于MATLAB的定制绘图程序，结合一个允许我们永久标记注入寄生虫蛋白质的神经元的小鼠模型，我们发现弓形虫-注入的神经元（TIN）在大脑中分布不均匀，主要位于皮层，其次是纹状体。此外，我们确定皮层TIN通常是（>50%）兴奋性神经元（FoxP2+)纹状体TIN通常是（>65%）中等棘神经元（MSN）（FoxP2+). 通过对纹状体TIN和邻近未感染MSN进行单神经元膜片钳技术，我们发现TIN具有高度异常的电生理学。由于大约90%的TIN会在感染后8周内死亡，这种异常的生理学表明注射弓形虫蛋白质直接或间接影响神经元的健康和存活。总的来说，这些数据首次揭示了神经元与弓形虫以及这些相互作用如何在体内改变神经元生理学。

关键词：电生理学；传染病；本地化；微生物学；小鼠；神经科学；弓形虫。

简明扼要的语言总结

弓形虫是一种感染大脑的细胞内寄生虫。尽管大多数脑部微生物感染会导致严重疾病或死亡，弓形虫感染通常是无症状的。这是因为寄生虫通过抑制免疫反应而进化出在大脑中生存的能力。因此，这种寄生虫可以与宿主无症状地共存数年甚至一辈子。事实证明，这一策略非常成功，目前世界上多达三分之一的人口被认为感染了弓形虫虽然这种持续性对大多数健康人来说并不成问题弓形虫寄生虫可以在免疫系统失效的个体中重新激活。这可能导致危及生命的神经疾病。在孕妇中，弓形虫寄生虫也可以穿过胎盘，这可能会引发流产或导致新生儿的有害疾病。为了开发针对这些症状性疾病的治疗方法，我们需要了解寄生虫如何躲避无症状个体的免疫系统。因此，Mendez等人利用了一种小鼠模型，在该模型中，神经元注射弓形虫蛋白质(弓形虫-注入的神经元（或“TIN”）产生绿色荧光蛋白。这样可以在显微镜下观察感染细胞。对小鼠大脑的检查显示，大多数TIN位于两个特定区域：皮层和纹状体。皮层是大脑组织的外层。纹状体是大脑深处的一种结构，有助于调节运动和对奖励的反应。皮层和纹状体都含有不同类型的神经元。结果表明，寄生虫的蛋白质在不同的细胞类型中分布大致相同，而不是针对特定的神经元亚型。靠近TIN的神经元有轻微异常的电活动，而TIN本身有高度异常的活动。然而，到感染后八周，TINS的数量下降了约90%。这表明许多神经元含有弓形虫蛋白质正在生病和死亡，它们改变的电活动反映了这种不健康的状态。了解如何弓形虫脑内持续存在的寄生虫有可能揭示治疗症状性感染的新靶点。它甚至可以为针对导致许多其他神经疾病的炎症提供新的可能性。利用这一潜力需要找出原因弓形虫感染特定的大脑区域，以及为什么大多数与寄生虫直接互动的神经元会死亡。

PubMed免责声明

利益冲突声明

OM、EF、JL、AK未宣布竞争利益

数字

图1。
图1。。弓形虫-注射神经元（TIN）在感染后3周显示出对皮层的偏爱。
Cre报告小鼠感染了II型Cre或III型Cre弓形虫寄生虫如图所示。如前所述，对大脑进行采集、切片、标记和量化（Mendez等人，2018年）。(A、 B类)TIN绝对数量图映射到大脑的12个区域。(C、 D类)TIN/区域的图形标准化为区域的大小。虚线为1，在该值处，TIN的分布将被视为与区域大小成比例。棒材，平均值±扫描电镜。N=16–19/节/鼠标。单个颜色表示来自单个队列的动物，对于II-Cre感染小鼠，N=4-12只/队列，对于III-re感染小鼠则为2-11只/队列。(C、 D类)*p=0.0170，**p=0.0021，***p≤0.0001，单样本t检验。所有区域的p值都在补充文件2中。如果GFP存在，则将小鼠排除在分析之外+细胞不高于GFP背景率+盐水注射的Cre报告小鼠中的细胞，或者如果通过ROUT异常值测试确定为异常值，则排除队列1（红色）III Cre感染的小鼠。图1-图补充1包括所有小鼠，并使用Allen Institute的所有切片进行标准化/浓缩指数。
图1——图补充1。
图1-图补充了1.所有小鼠的原始数据，并使用了完整的艾伦阿特拉斯区域。
Cre-reporter小鼠感染II-Cre或III-Core弓形虫寄生虫如图所示。大脑按图1所示进行采集、切片、标记和分析。(A、 B类)绝对数的图形弓形虫-注入的神经元（TIN）映射到大脑的12个区域。(C、 D类)根据区域大小标准化的TIN编号/区域图。虚线表示TIN分布被视为随机且适合区域大小的值。提供的数据是在排除任何老鼠之前。排除依据是（i）TIN总数小于或等于总GFP+ 盐水注射小鼠的中枢神经系统（CNS）细胞或（ii）通过ROUT方法鉴定为异常值。棒材，平均值±SEM。
图1—图补充2。
图1补充图2。视觉、体感和运动皮层是高度丰富的皮层区域，包含弓形虫-注入神经元（TIN）。
(A类)显示II-Cre感染小鼠大脑皮层TIN在运动（MO）、体感（SS）和视觉（VIS）皮层的标准化分布的图表。(B类)如中所示(A类)III-核心感染小鼠除外*通过单样本t检验，p≤0.05，**p=0.01，**p≤0.0005。个别颜色表示来自同一队列的小鼠。虚线表示TIN分布被视为随机且适合区域大小的值。线，平均值±SEM。
图2。
图2。。弓形虫-注入的神经元（TIN）很少与抑制性中间神经元共存。
用抗NeuN抗体和抗钙结合蛋白或抗小白蛋白抗体对II-Cre或III-Core感染小鼠的40微米脑切片进行染色。然后通过共焦显微镜对染色切片进行成像，以确定TIN（GFP）之间的共定位+)和钙结合蛋白（Calb）或小白蛋白（PV）染色。(A类)小腿染色切片中皮质区域的代表性图像。(B类)与Calb染色共同定位的TIN百分比的量化。(C类)如中所示(A类)除了大脑皮层区域的PV染色图像。(D类)如中所示(B类)PV量化除外。(E类)如中所示(A类)但在纹状体。(F类)如中所示(B类)纹状体小腿定量除外。对于(A、 C、E)合并图像，灰色=NeuN，红色=Calb或PV，绿色=GFP。N=9节/只小鼠，小腿7只/组，PV 2-4只/组。(B、 D、F)棒材，平均值±SEM。(B类)对于II-Cre感染小鼠，分析了24-127个TINs/小鼠；对于III-核心感染小鼠，分析了254–503个TINs/小鼠。(D类)对于II-Cre，分析了8-68个TINs/小鼠，对于III-Core，分析了281346个TIN/小鼠。(F类)对于II-Cre感染小鼠，分析了3–290个TINs/只；对于III-核心感染小鼠，分析了21-214个TINs/小鼠。各组之间未发现显著差异，即Student t检验。
图3。
图3。。弓形虫-注射神经元（TIN）与FoxP2和DARPP32染色共同定位。
用抗NeuN抗体和抗FoxP2或抗DARPP32抗体对II-Cre或III-Core感染小鼠的脑切片进行染色。DARPP32染色仅在纹状体进行。然后用共焦显微镜分析染色切片，以确定TIN（GFP）之间的共定位+)FoxP2或DARPP32染色。(A类)根据标记染色的切片中皮层区域的代表性图像。(B类)与FoxP2染色共定位的TIN百分比的量化。(C类)如中所示(A类)除了图像是纹状体区域。(D类)如中所示(B类)纹状体TIN除外。(E类)如中所示(C类)但组织被抗DARPP32抗体染色（如标签所示）。(F类)如中所示(D类)除了TIN和DARPP32染色之间的共定位。(A、 C、E)合并图像，灰色=NeuN，红色=FoxP2或DARPP32，绿色=GFP。比例尺=50µm。(B、 D、F)棒材，平均值±SEM。对于(B、 D、F)N=9节/只小鼠，7只/组。(B类)对于II-Cre感染小鼠，共分析了24-127个TINs/小鼠；对于III-核心感染小鼠，分析了254–503个TINs/小鼠。(D类)对于II-Cre感染小鼠，共分析了28–68个TINs/小鼠；对于III-核心感染小鼠，分析了290–858个TINs/小鼠。(F类)对于II-Cre感染小鼠，分析了6–237个TINs/小鼠；对于III-核心感染小鼠，分析了16-198个TINs/小鼠。各组之间未发现显著差异，即Student t检验。
图3——图补充1。
图3——图补充1：FoxP2的量化+或DARPP32+纹状体中的神经元。
用抗NeuN抗体和抗FoxP2或抗DARPP32抗体对来自盐水或II-Cre或III-Cre接种的小鼠的脑切片进行染色。然后分析染色切片中FoxP2的数量+或DARPP32+神经元。(A类)FoxP2的平均数量+随机采样纹状体时的神经元/图像。(B类)FoxP2的平均数量+在TIN附近采样时的神经元。(C类)如中所示(A类)，但对于DARPP32+神经元（随机抽样）。(D类)如中所示(B类)但对于DARPP32+神经元（TIN附近）。棒材，平均值±SEM。N=9节/只小鼠，31-44张图像/只小鼠、3-7只小鼠/组*p<0.05，采用Dunnett后验进行单因素方差分析。
图3——图补充2。
图3-图补充2.DARPP32的基线量化+和福克斯P2+纹状体共定位。
对盐水、II-Cre或III-Core接种小鼠的脑切片进行FoxP2和DARPP32染色。(A类)FoxP2的百分比+与DARPP32标记共同定位的神经元。(B类)DARPP32的百分比+与FoxP2标记共同定位的神经元。棒材，平均值±SEM。N=9个切片/只小鼠，31-44个图像/只小鼠，3-4只小鼠/组。各组之间无显著差异，采用Dunnett的后验进行单因素方差分析。
图4。
图4中等棘状神经元（MSN）的电生理神经元与DARPP32染色共同定位。
(A类)所示神经元的样本跟踪。注意超极化静息膜电位为−80 mV，第一动作电位的延迟时间。(B类)充满神经生物素的修补神经元的图像。箭头指向填充的神经元。虚线表示充满生物素的血管。(C类)DARPP32染色图像。记录和填充后，固定切片并用抗DARPP32抗体进行反标记。(D类)图像的合并B类和C类(B–D类)切片在蔡司880共焦显微镜上成像。所示图像是从100µm z堆栈中投影的最大值为12，1µm阶跃图像。比例尺=50µm。
图5。
图5：旁观者中棘神经元（MSN）的电生理学与未感染小鼠的MSN相似。
(A类)未感染小鼠（−74.9±2.1 mV）的全细胞贴片夹持MSN和感染小鼠（–68.7±4.0 mV）中的旁观者MSN的静息膜电位图。(B类)动作电位（AP）阈值(C类)超极化峰后(D类)AP振幅(E类)延迟到第一个AP(F类)AP间隔，以及(G公司)来自未感染小鼠的MSN和感染小鼠的旁观者MSN的输入阻力。点表示单个MSN。匹配的色点表示来自同一鼠标的细胞。未感染MSN，N=28个细胞，来自14只小鼠，每只小鼠记录1-5个细胞。旁观者MSN，N=40个细胞，从18只小鼠中记录，1-5个细胞/只小鼠。直线，平均值±SEM***p=0.0007，Mann-Whitney U检验。
图5——图补充1。
图5——图补充件1.旁观者和弓形虫-在记录过程中注入神经元（TIN）。
旁观者神经元是与TIN处于相同炎症微环境中但未注射TIN的神经元弓形虫蛋白质。纳税人识别号（GFP+)包括感染和未感染的神经元，90%以上的TIN不含寄生虫（Koshy等人，2012年）。在记录过程中，未观察到带有囊肿的TIN。旁观者=米色神经元，TINs=绿色神经元，红色液泡=弓形虫囊肿。
图5——图补充2。
图5补充图2。旁观者中棘神经元（MSN）比未感染对照组的MSN更快激发第一动作电位（AP）。
为了在斑贴神经元中启动AP放电，向斑贴神经元注入20步超极化和去极化电流（Wang等人，2019）。该图显示了每个神经元激发其第一个AP的步数。点表示单个MSN。线，平均值±SEM**通过非配对双尾学生t检验，p=0.0014。
图6。
图6不同于旁观者神经元，弓形虫-注入神经元（TIN）具有高度异常的电生理学。
(A类)未感染小鼠（−74.9±2.1 mV）的全细胞膜片钳中棘神经元（MSNs）和感染小鼠的旁观者MSNs（−68.7±4.0 mV）和TINs（-49.1±4.5 mV）静息膜电位图**p=0.0086，***p=0.001，采用Tukey后验进行单因素方差分析。对于TIN，从六只小鼠中记录的N=10个细胞；图5所示的未感染者和旁观者。黑色箭头标识TIN，如(B类). 线，平均值±SEM。(B类)顶部：超极化后来自TIN的痕迹示例。底部：可视化当前注入协议的一部分。通过注入−180 pA的电流，所识别的TIN超极化至−60 mV的静息膜电位。红色箭头表示单个超极化步骤。数字（1、4）与电压测量值（跟踪）与电流增加的步骤相匹配。注意，在增加电流的第四步骤中最终产生动作电位。
图6——图补充1。
图6-图补充1.的代表性图像弓形虫-用于记录的注入神经元（TIN）。
图像来自III-核心感染小鼠200µm厚的脑切片。照片是在奥林巴斯BX51上拍摄的。红色圆圈勾勒出已修补的TIN。比例尺=20µm。
图6——图补充2。
图6——图补充2..YFP+ 感染小鼠的皮层神经元表现出典型的静息膜电位。
除脑片来自感染的thy1-YFP小鼠外，记录程序如图4-6所示（Feng等人，2000年）。(A–C)YFP的代表图像+用于记录的神经元。图像来自一只III-核心感染的thy1-YFP小鼠200µm厚的大脑切片。如图6补充图1所示拍摄图像。比例尺=10µm。(D类)全细胞膜片钳式YFP静息膜电位图+来自两只小鼠的皮层神经元，N=4。线，平均值±SEM。
图7。
图7.数量弓形虫-注射神经元（TINs）在感染后8周（wpi）减少。
小鼠被感染，在3或8 wpi时，按照图1进行分析，但总TIN数量被量化。线，平均值±SEM***p≤0.0001，Mann-Whitney U检验；16–19节/只小鼠，N=9–11只小鼠/时间点。
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