Helicase-like transcription factor-deletion from the tumor microenvironment in a cell line-derived xenograft model of colorectal cancer reprogrammed the human transcriptome-S-nitroso-proteome to promote inflammation and redirect metastasis

doi:10.1371/journal.pone.0251132

.2021年5月19日；16（5）：e0251132。

doi:10.1371/journal.pone.0251132。 eCollection 2021年。

结直肠癌细胞系衍生异种移植模型中肿瘤微环境中螺旋状转录因子的缺失使人类转录组S-亚硝基-蛋白组重新编程以促进炎症和转移

丽贝卡A Helmer¹, 劳尔·马丁内斯·扎吉兰², 古温德·考尔^三, 丽莎·史密斯⁴, 珍妮特·杜福尔¹, 贝弗利·S·奇尔顿^1 5

附属公司

¹美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心细胞生物学与生物化学系。
²美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心细胞生理学和分子生物物理系。
^三美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心医学教育部。
⁴美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心病理学系。
⁵美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心医学院癌症中心。

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结直肠癌细胞系衍生异种移植模型中肿瘤微环境中螺旋状转录因子的缺失使人类转录组S-亚硝基-蛋白组重新编程以促进炎症和转移

丽贝卡A Helmer等。公共科学图书馆一号. 2021.

.2021年5月19日；16（5）：e0251132。

doi:10.1371/journal.pone.0251132。 eCollection 2021年。

作者

丽贝卡A Helmer¹, 劳尔·马丁内斯·扎吉兰², 古温德·考尔^三, 丽莎·史密斯⁴, 珍妮特·杜福尔¹, 贝弗利·S·奇尔顿^1 5

附属公司

¹美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心细胞生物学与生物化学系。
²美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心细胞生理学和分子生物物理系。
^三美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心医学教育部。
⁴美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心病理学系。
⁵美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心医学院癌症中心。

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摘要

结直肠癌（CRC）细胞中HLTF基因甲基化在男性中发生的频率高于女性。肿瘤细胞中HLTF的进行性表观遗传沉默伴随着肿瘤微环境（TME）中可忽略的表达。通过直接将Hltf+/+HCT116 Red-FLuc细胞原位微注射（OCMI）至盲肠粘膜下层，在对照组（Hltf+/+）和Hltf-缺失雄性Rag2-/-IL2rg-/-小鼠中建立细胞系衍生异种移植物（CDX）。在Hltf-缺失的TME中，IL6和S100A8/A9与原发肿瘤中的ICAM-1和IL8联合诱导激活了正反馈回路。与对照组相比，促炎生态位使CDX转移向腹膜播散发生了重大转变。Hltf-缺失的TME中诱导性一氧化氮（iNOS）基因表达和iNOS-S100A8/A9信号复合物的反式激活重新编程人类S-亚硝基蛋白组。POTEE、TRIM52和UN45B在保守的I/L-X-C-X2-D/E基序上进行S-亚硝基化，该基序指示iNOS-S100A8/A9-介导的S-亚硝酸盐化。通过MALDI-TOF/TOF质谱法进行2D-DIGE和蛋白质鉴定，证实CDX肿瘤中53个半胱氨酸半位点基序（I/L-X-C或C-X-X-D/E）的S-亚硝基化。CDX肿瘤中的POTEE既是Hltf-缺失TME中的一般S-亚硝基化靶点，也是iNOS-S100A8/A9位点特异性（Cys638）靶点。REL是转录组S-亚硝基-蛋白质信号聚合的一个例子。该基因在具有Hltf-缺失TME的CDX肿瘤中转录激活，在原发性CDX肿瘤和所有转移部位发现REL-SNO（Cys143）。Hltf-缺失TME的原发性CDX肿瘤与所有转移部位共享60%的S-亚硝基蛋白组。原发性CDX肿瘤中40%的SNO蛋白在转移部位有不同的表达。细胞骨架和运动相关通路中蛋白质的全局S-亚硝基化与CDX肿瘤的转移播散密切相关。当肿瘤细胞表达Hltf时，TME中的Hltf缺失在原发性CDX肿瘤的炎症和连接蛋白S-亚硝基化的发病机制中起主要作用，并且在转移过程中具有时空连续性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

没有作者有相互竞争的兴趣。

数字

**图1。Kaplan-Meier生存图。**
男性累积生存曲线的比较*高密度光纤-*删除小鼠（n=20）和对照小鼠（n=12）显示，小鼠存活到研究结束，即手术后35天的总概率不受基因型的影响。

**图2。无区域淋巴结转移的pT3腺癌中的HLTF蛋白（pN0）。**
来自管状卵泡腺瘤（息肉）的腺癌的高分化（G1）癌细胞中的HLTF-免疫抑制。肿瘤细胞通过固有肌层侵入肝曲的结直肠周围组织。没有淋巴血管侵犯的证据。图A-C中的显微照片显示了由HLTF阳性癌细胞和HLTF阴性成纤维细胞组成的肿瘤组织的细胞结构。A（放大4倍）、B（放大10倍）和C（放大20倍）。HLTF N末端（残基164–300）的抗体是所有已知人类HLTF蛋白[21]在细胞核和细胞质位置共有的，显示阳性免疫染色（棕色）主要是细胞质，但不限于细胞质。HLTF阴性成纤维细胞（蓝色箭头）缺乏细胞核和/或细胞质染色。

**图3。直接原位细胞显微注射（OCMI）。**
对照组小鼠接受2x10的直接OCMI⁶ *高密度光纤*^+/+HCT116 Red-FLuc细胞/10μl注入可变尺寸（3-4 cm）J形盲肠粘膜下层（A）。体内在IP注射D-荧光素（B）后进行BLI（1秒暴露）。50μl Hamilton注射器配有30GA/0.5英寸/30度定制针头，消除了逆向泄漏。确认细胞信号真实性（C）*在体外*（cm=培养基，luc=荧光素）。BLI强度（D）从红色（最高）到黄色、绿色、蓝色和紫色（最低）不等。苏木精和伊红染色对临床上最相关转移部位肿瘤病灶的组织病理学证实与对照小鼠的BLI（E）相一致。同一小鼠的BLI和组织病理学显示进展。

**图4。免疫检测、BLI、常规组织化学和HLTF免疫组织化学的代表性图像。**
通过HCT116 Red-FLuc细胞（A）免疫沉淀蛋白的Western blot检测全尺寸HLTF蛋白（~115-kDa）。HLTF抗体（残基600-700）识别所有已知和推测的截短小鼠蛋白质[35]。BLI显示原发性肿瘤异种移植物的转移特性（局部侵袭和远处集落形成）在*Hltf公司*-删除了微环境（A）。尸检时，切除原发性异种CDX肿瘤（B）进行常规组织病理学检查（苏木精和伊红染色；放大4倍）。原发性异种CDX肿瘤（C）HLTF免疫染色阳性。免疫染色*高密度光纤*^+/+TME与*高密度光纤*-删除TME（放大25倍）。HLTF抗体（残基164-300）识别所有已知的人类和小鼠蛋白质[35]。

**图5。CDX转移的影像学研究*Hltf公司-*尸检时删除小鼠。**
用异氟醚麻醉小鼠，尸检前用BLI（A）检测转移性CRC。安乐死后，立即通过中矢状切口打开小鼠，先切除原发性CDX肿瘤（B1），然后切除胃和脾脏附近的淋巴结（B2）。膈下（B3）和膈上（B4）转移性胸骨淋巴结和腹膜癌（B5）一样被切除。对小鼠进行第二次成像（C），以指导移除腹股沟淋巴结（D6）和延伸至阴囊的转移组织（D7）。对所有组织进行人类蛋白质S-亚硝基化评估。

**图6。基因测量表达条形图和验证性免疫组织化学。**
所有DE基因根据其绝对对数倍变化进行排序。上调基因显示为红色，下调基因显示为蓝色。每个直方图左侧的方框图和胡须图总结了所有DE基因在特定路径中的分布，或注释为所有目标基因中的GO项。方框表示第一个四分位、中间值和第三个四分位数。促炎细胞因子的mRNA（A）和蛋白表达增加，*IL8号机组*（B）和*ICAM-1公司*（C）发生在人类肿瘤中*Hltf公司*-删除TME（放大40倍）。TME中没有IL8染色，因为*IL8号机组*是人类基因组独有的，即没有*IL8号机组*小鼠中的同源物。消息中的日志折叠增加*等级6*iNOS-S100A8/A9信号轴的所有成员都记录在小鼠体内*高密度光纤*-删除TME（D）。记录邮件中的折叠更改惠普（增加，p=0.01），*SERPINA3系列*（增加，p=0.01）和*HGF公司*CDX肿瘤（减少，p=0.043）*高密度光纤*-删除的TME在火山图（E）中用黄色圆点高亮显示。水平轴是对数折叠变化，垂直轴是p值的以10为底的负对数。红线表示阈值。上调基因（正长折叠变化）显示为红色，而下调基因显示为蓝色。未受影响的基因是黑色的。

**图7。iNOS-S100A8/A9信号轴的免疫组织化学。**
增加的S100A8/A9仅适用于*高密度光纤*-删除了鼠标TME。S100A8和S100A9通常形成异二聚体（S100A8/A9，钙卫蛋白），而同二聚体通常无法检测到。S100A8/A9表达增加与iNOS蛋白水平增加相一致*高密度光纤*-删除了鼠标TME。内源性iNOS表达增加是炎症的主要介质，与转移增加导致CRC患者生存率降低相关。

**图8。2D-DIGE凝胶电泳。**
出于数据展示的目的，凝胶中只显示了选定的斑点。pH值范围4至9显示在x轴上（红色水平线）。分子质量（20–180 KD）显示在y轴上。对差异表达的蛋白质进行MALDI-TOF/TOF分析。

**图9。蛋白质相互作用（PPI）网络。**
对原发性肿瘤和所有转移部位的蛋白质进行聚类分析，PPI富集p值<1.0e-16，表明共享SNO蛋白作为一个组在生物学上相连。通过将置信度设置为0.900的最高水平，并将FDR严格性设置为中等（5%），可以提高假定交互作用的可靠性。对于二次分析，只为网络选择了基于数据的源交互，并消除了网络中所有断开连接的节点。与本分析相关的GO术语如下。GO:0030049（橙色）肌丝滑动（1.29e-09），GO:0007018（蓝色）微管带运动（5.15e-08）；GO:00030048（黄色）肌动蛋白丝状运动（7.48e-10）；GO:0006928（绿色）细胞或亚细胞成分的运动（7.73e-05）。

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[1] Seyfriend TN，Huysentruyt LC。关于癌症转移的起源。2013年Oncog评论版；18（1-2）：43–73。10.1615/critevoncog.v18.i1-2.40-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Keum N，Giovannucci E.结直肠癌的全球负担：新趋势、风险因素和预防策略。Nat Rev胃肠肝素。2019;16:713–732，10.1038/s41575-019-0189-8-内政部-公共医学

[10] Keum N，Giovannucci E.结直肠癌的全球负担：新趋势、风险因素和预防策略。Nat Rev胃肠肝素。2019;16:713–732，10.1038/s41575-019-0189-8-内政部-公共医学

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