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.2021年4月27日；16(1):419-430.
doi:10.155/生物-2021-0044。 eCollection 2021年。

阻断circ_UBR4抑制动脉粥样硬化中人类血管平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞周期进展

张颖（音） 1, Cheng Zhang（张成） 1, 陈宗伟 1, 王美兰 1
附属机构

阻断circ_UBR4抑制动脉粥样硬化中人类血管平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞周期进展

张颖（音）等。 开放式生命科学. .

摘要

circ_UBR4（hsa_circ_0010283）是氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人类血管平滑肌细胞（VSMC）动脉粥样硬化（AS）模型中一种新的异常过度表达的circRNA。然而，其在VSMC功能障碍中的作用有待进一步研究。在这里，我们试图通过调节作为AS治疗靶点的Rho/Rho-相关联的线圈含激酶1（ROCK1）来探讨其在ox-LDL诱导的VSMC过度增殖和迁移中的作用。circ_UBR4和ROCK1的表达上调，而miR-107在人类AS血清和ox-LDL-诱导的VSMCs中下调。尽管ox-LDL具有相反的作用，但circ_UBR4的耗尽阻止了细胞周期，抑制了细胞活力、克隆形成能力和迁移能力，并抑制了VSMC中增殖细胞核抗原和基质金属蛋白酶2的表达。值得注意的是，通过质粒转染或miR-107缺失介导的ROCK1上调可以抵消circ_UBR4敲低在ox-LDL诱导的VSMC增殖、迁移和细胞周期进展中的抑制作用。在机制上，miR-107被确定为circ_UBR4的靶点，以介导circ_UBR4对ROCK1的调节作用。circ_UBR4可能通过circ_UBR4/miR-107/ROCK1途径调节VSMC的细胞增殖、迁移和细胞周期进程，在人类AS中起部分作用。

关键词：岩石1；VSMC；动脉粥样硬化；circ_UBR4；miR-107。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
在人AS血清和ox-LDL诱导的VSMC中，circ_UBR4（hsa_circ_0010283）的表达上调。RT-qPCR检测（a）AS患者血清中circ_UBR4的表达水平；n个=41）和正常对照组（正常；n个=41），和（b）用不同浓度的ox-LDL处理24小时的人VSMC h.（c和d）RT-qPCR测量了（c）用RNase R或Mock处理的提取RNA中circ_UBR4及其宿主基因UBR4的水平，以及（d）100 μg/mL ox-LDL处理的VSMC经ActD处理*P（P）< 0.05.
图2
图2
circ_UBR4缺失在ox-LDL诱导的人类VSMC的细胞周期进展、增殖和迁移中的抑制作用。（a） RT-qPCR检测转染siRNA靶向circ_UBR4（si-circ-UBR4）的VSMC中circ_UBR4和UBR4的表达水平，并将其归一化为阴性对照（si-NC）转染。（b–g）VSMC与siRNA转染共同处理24小时 h和ox-LDL（100 μg/mL）处理另一个24 h.（b）FCM通过计数细胞数分析不同细胞周期阶段（G0/G1、S和G2/M）的细胞分布。（c） 集落形成试验通过测定集落数来测定集落形成能力。（d） CCK-8分析通过分析570时的OD值监测细胞活力 纳米。（e） Western blotting检测增殖标记PCNA的表达。（f） Transwell分析通过计算迁移细胞的数量来评估细胞迁移能力。（g） Western blotting检测迁移标记物基质MMP2的表达*P（P）< 0.05.
图3
图3
Rho/Rho-相关联的线圈含激酶1（ROCK1）抵消了ox-LDL诱导的人类VSMC中circ_UBR4耗竭的作用。（a和b）RT-qPCR和western blotting检测了转染si-NC、si-circ_UBR4、si-corc_UBR2、pcDNA质粒（pcDNA）、si-carc_UBR1和pcDNA-ROCK1质粒（ROCK1）的VSMC中ROCK mRNA表达水平和蛋白表达水平。（c–h）VSMC与上述转染共同处理24小时 h和ox-LDL（100 μg/mL）处理另一个24 h.（c）FCM分析了G0/G1、S和G2/M期的细胞数量。（d） 菌落形成试验确定菌落数量。（e） CCK-8分析监测570时的OD值 纳米。（f） Western blotting检测PCNA蛋白表达水平。（g） Transwell分析评估迁移细胞的数量。（h） Western blotting检测MMP2蛋白表达水平*P（P）< 0.05.
图4
图4
miRNA（miR）-107直接与circ_UBR4和ROCK1相互作用。（a和g）Starbase3.0软件预测了miR-107在（a）野生型circ_UBR4（circ_WBR4-wt）和（g）野生型ROCK1在3′非翻译区（ROCR1 3′UTR-wt）的潜在互补位点。黑盒中的红色为结合位点，黑盒中红色为突变型circ_UBR4（circ_UBR4-mut）和突变型ROCK1（ROCK1 3′UTR-mut）中的突变位点。（b和h）双荧光素酶报告子分析测定了转染miR-107模拟物（miR-107）或其阴性对照（miR-NC）的VSMC中携带（b）circ_UBR4-wt或circ_UBR4-mut，以及（h）ROCR1-wt或ROCR1-mut的载体的荧光素酶活性。（c和d）RT-qPCR检测转染si-NC或si-circ_UBR4的VSMCs以及AS和正常组的血清样本中miR-107的表达水平。（e） Pearson相关分析确定了人AS血清中circ_UBR4和miR-107表达之间的相关性。（f） RT-qPCR检测ox-LDL中miR-107的表达水平（100 μg/mL）处理的人VSMCs。（i–k）VSMC转染miR-NC、miR-107、miR-107-5p抑制剂（抗miR-107）或阴性对照（抗-miR-NC），然后（i和j）RT-qPCR测量miR-107表达水平和ROCK1 mRNA表达水平，（k）western blotting检测ROCK1蛋白表达水平。（l） RT-qPCR检测AS组和正常组血清中ROCK1 mRNA的表达水平。（m和n）Pearson相关分析确定了ROCK1 mRNA与人类AS血清中miR-107或circ_UBR4表达之间的关系。（o） Western blotting检测了AS患者和正常人三组血清样本中ROCK1蛋白的表达水平。（p和q）RT-qPCR和western blotting检测到ox-LDL中ROCK1的表达（100 μg/mL）处理的人血管平滑肌细胞在mRNA水平和蛋白质水平*P（P）< 0.05.
图5
图5
沉默miR-107可以消除ox-LDL诱导的人类VSMC中circ_UBR4耗竭的作用。（a） RT-qPCR检测了单独转染si-NC、si-circ_UBR4或与抗-NC或抗-miR-107联合转染的VSMC中miR-107的表达水平。（b–g）VSMC与上述转染共同处理24小时 h和ox-LDL（100 μg/mL）处理另一个24 h.（b）FCM分析G0/G1、S和G2/M期的细胞数量。（c） 菌落形成试验确定菌落数量。（d） CCK-8分析监测570时的OD值 纳米。（e） Western blotting检测PCNA蛋白表达水平。（f） Transwell分析评估迁移细胞的数量。（g） Western blotting检测MMP2蛋白表达水平*P（P）< 0.05.
图6
图6
circ_UBR4通过miR-107调节调节人类VSMC中ROCK1的表达。（a和b）RT-qPCR和western blotting检测了单独转染si-NC、单独转染si-circ_UBR4或与anti-NC或anti-miR-107联合转染的VSMC中ROCK1的表达水平*P（P）< 0.05.
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