Selective packaging of mitochondrial proteins into extracellular vesicles prevents the release of mitochondrial DAMPs

doi:10.1038/s41467-021-21984-w

.2021年3月30日；12(1):1971.

doi:10.1038/s41467-021-21984-w。

线粒体蛋白选择性包装到细胞外囊泡中可防止线粒体DAMP的释放

附属公司

¹加拿大魁北克省特洛伊斯·里维耶尔魁北克大学信号细胞研究小组和生物医学研究部。
²加拿大魁北克CERMO-FC UQAM。
³加拿大魁北克省魁北克大学，魁北克理工大学，魁圣大学，Recherche en Santéde l’universityéu Intersectoriel de Recherche en Que bec。
⁴加拿大魁北克省Trois Rivières市Trois Rivières魁北克大学Cellulaire信号研究小组和生物医学部。marc.german1@uqtr.ca。
⁵加拿大魁北克CERMO-FC UQAM。marc.german1@uqtr.ca。
⁶加拿大魁北克省魁北克大学，魁北克理工大学，魁圣大学，Recherche en Santéde l’universityédu Québec Intersectoriel。marc.german1@uqtr.ca。

PMID： 33785738
预防性维修识别码： PMC8009912
内政部： 10.1038/s41467-021-21984-周

线粒体蛋白选择性包装到细胞外囊泡中可防止线粒体DAMP的释放

基兰·托德卡等。国家公社. 2021.

.2021年3月30日；12(1):1971.

doi:10.1038/s41467-021-21984-w。

附属公司

¹加拿大魁北克省特洛伊斯·里维耶尔魁北克大学信号细胞研究小组和生物医学研究部。
²加拿大魁北克CERMO-FC UQAM。
³加拿大魁北克省魁北克大学圣德学院研究所。
⁴加拿大魁北克省特洛伊斯·里维耶尔魁北克大学信号细胞研究小组和生物医学研究部。marc.german1@uqtr.ca。
⁵加拿大魁北克CERMO-FC UQAM。marc.german1@uqtr.ca。
⁶加拿大魁北克省魁北克大学，魁北克理工大学，魁圣大学，Recherche en Santéde l’universityéu Intersectoriel de Recherche en Que bec。marc.german1@uqtr.ca。

PMID： 33785738
预防性维修识别码： PMC8009912
内政部： 10.1038/s41467-021-21984-周

摘要

大多数细胞在细胞外小泡（EV）中组成性地分泌线粒体DNA和蛋白质。EV是在细胞之间传递物质的小泡，而线粒体衍生囊泡（MDV）则在线粒体和其他细胞器之间特异性地携带物质。尽管线粒体在无炎症状态下的作用尚不明确，但在促炎症状态下，线粒体的含量可以增强炎症。在这里，我们证明细胞可以积极阻止前炎症、氧化线粒体蛋白的包装，这些蛋白将作为损伤相关分子模式（DAMP）进入EV。重要的是，我们发现要纳入EVs的物质和要排除的受损线粒体含量之间的区别取决于对两种不同的MDV途径之一的选择性靶向。我们发现，视神经萎缩1（OPA1）和分选nexin 9（Snx9）依赖性MDV需要将线粒体蛋白靶向EVs，而帕金森病相关蛋白Parkin通过将受损的线粒体内容物引导到溶酶体来阻断这一过程。我们的结果提供了线粒体质量控制机制和线粒体驱动免疫反应之间相互作用的见解。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。线粒体和EV激活不同的促炎细胞因子。**
一,b条细胞外线粒体诱导促炎细胞因子的分泌。线粒体（Mito）（从MEF中分离）或EV（通过差速离心从培养24小时的MEF培养基中分离 h）添加到其培养基中的RAW细胞中。IL6的发布(一)和IP10(b条)通过ELISA 24测定培养基中的 h.单个点代表独立实验(一,n个 = 三；b条,n个 = 4). 条形图显示平均值 ± SD.单向方差分析。**c（c）**代表性的western blot显示了指定细胞类型（20 µg）与电动汽车（5 微克）。TOM20，外膜蛋白；NDUFA9，复合物I亚基；与IM相关的mtHSP70基质蛋白；PDH，基质蛋白。肌动蛋白被用作控件，因为它与电动汽车有关。d日AA处理的MEFs线粒体刺激IP10的产生。用EV如上所述处理RAW细胞（从10 × 10⁶细胞）和线粒体（12 µg）从对照或AA-处理的MEF中分离，并通过ELISA测定培养基中IP10的释放。单个点代表独立实验（线粒体、，n个 = 4; 电动汽车，n = 6). 条形图显示平均值 ± SD.单向方差分析。**e（电子）**AA处理WT MEF会导致线粒体蛋白的选择性降解。MEF接受AA治疗24天 westernblot分析h和指示的线粒体蛋白。**（f）**在对照组（蓝色）和AA-处理组（24 h、红色）WT MEF。单个点代表独立实验(n个 = 4). 条形图显示平均值 ± SD.双面t吨-测试）。

**图2。EVs中线粒体蛋白的选择性包含。**
一20例EV标记物经western blot分析 µg细胞提取物和5 µg MEF EV，如图1所示。b条MEF EVs中蛋白质内含物的定量。EV中显示的蛋白质量按其细胞含量标准化。单个点代表独立的实验。条形图显示平均值 ± SD.Alix，外显子标记（蓝色）；层粘连蛋白B1，核蛋白；Rab9、Rab11、Snx9、内体蛋白；细胞色素c、IMS蛋白、OPA1、IM蛋白。线粒体蛋白质（绿色）、非线粒体蛋白质（红色）、线粒体DNA（紫色）。**c（c）**在无洗涤剂或有洗涤剂（TX100）的情况下，用胰蛋白酶处理上述分离的MEF EV，并通过western blot分析是否存在指示蛋白。d日–**（f）**EM分析MEF EV超微结构并根据结构进行量化(**e（电子）**)和尺寸(**（f）**). 代表性图像如所示(d日). 比例尺，200 纳米。克,小时含有选择性线粒体货物的囊泡靠近质膜（≤1 µm），但远离主要线粒体网络（>1 微米）。TOM20-阳性、mtHSP70-阳性或PDH-阳性囊泡的数量在(克)在四个独立的实验中，每个点代表具有血浆膜相关囊泡的细胞的分数。每个阳性细胞通常含有一个小泡。点表示独立实验，条形图表示平均值 ± SD。代表性图像如所示(小时)绿色荧光蛋白（蓝色）用作细胞溶质标记，以确定细胞边界。箭头表示靠近质膜的TOM20阳性囊泡。比例尺，2 微米。

**图3。Snx9依赖性MDV有助于将IM/基质蛋白纳入EV。**
一分别通向EV和溶酶体的两条不同MDV途径的示意图。b条MEF接受了24次治疗 h带有对照siRNA（siCtrl，蓝色）或针对Snx9的siRNA（SiSnx8，红色）。然后通过蛋白质印迹测定线粒体蛋白，肌动蛋白作为负载对照。**c（c）**显示用对照siRNA（siCtrl）或抗Snx9的siRNA（siSnx9）处理的MEFs中的TOM20和mtHSP70 MDVs的代表性图像。箭头表示MDV（一个标记为正值，另一个为负值）。比例尺：顶部面板，10 µm；底部面板中的放大，2 微米。d日根据图像进行MDV量化，如（c）所示。每个数据点代表一个单元格。条形图表示三个独立实验中40个细胞的平均值 ± SD.双面t吨-测试。**e（电子）**如图1所示，通过western blot测量所示线粒体蛋白的富集。单个点代表独立实验(n个 = 4). 条形图显示为平均值 ± SD.双面t吨-测试。

**图4。OPA1缺失抑制IM/基质MDV的形成。**
PDH阳性MDV的量化(一)，mtHSP70(b条)，NDUFA9（TOM20-负极）(**c（c）**)，以及TOM20-阳性（mtHSP70-阴性）(d日)WT（蓝色）和OPA1 KO（红色）MEF的免疫荧光图像。每个数据点代表一个单元格。条形图表示23个单元格的平均值（PDH除外，其中n个 = 20）在三个独立的实验中 ± SD.双面t吨-测试。

**图5。OPA1调节IM/基质蛋白和mtDNA进入EV。**
一EV蛋白产量相对于WT和OPA1 KO EV中细胞蛋白含量的量化，如图1所示。每个点代表一个实验(n个 = 7). 条形图显示平均值 ± 标准偏差。b条OPA1删除不会改变EV的总体大小。通过EM分析WT和OPA1 KO EV大小，并按指示进行装箱。每类电动汽车的平均百分比 ± 显示SD(n个 = 3). 没有大于800的电动汽车检测到nm。**c（c）**,d日OPA1缺失后，细胞质蛋白在EVs中的包含没有改变。代表性蛋白质印迹(**c（c）**)和量化(d日)如图1所示。单个点代表独立实验(n个 = 3). 条形图显示平均值 ± 标准偏差。**e（电子）**–克OPA1缺失可阻止IM/基质蛋白（而非TOM20）进入EV。代表性西部(**e（电子）**)和量化，如图1所示(**（f）**). mtDNA通过PCR定量(克)单个点代表独立的实验。条形图显示平均值 ± SD.双面t吨-测试。WT（蓝色），OPA1 KO（红色）。

**图6。从同一细胞中分离的OPA1 KO线粒体而非EV诱导IP10炎症反应。**
一,b条如图1所示，用线粒体处理RAW细胞（Mito，12 微克）(一)或电动汽车（从10 × 10⁶单元格）(b条)从WT或OPA1 KO MEF中分离并用ELISA测定培养基中IP10的释放。单个点代表实际浓度（或归一化为WT(b条)，右面板）在独立实验中（Mito，n个 = 6; 电动汽车，n个 = 4). 条形图显示平均值 ± SD.单向方差分析，双面t吨-测试(b条)，右侧面板。**c（c）**OPA1 KO EVs显示IFN依赖基因的表达降低。RAW细胞按(一–b条)IFN依赖基因的mRNA水平*Rsad2号机组*（左）和*毫伏1*（右）通过qPCR测量。单个点代表独立实验(*Rsad2号机组*,n个 = 6;*毫伏1*,n个 = 4). 条形图显示平均值 ± SD.单向方差分析。d日,**e（电子）**RAW细胞按照(一,b条)并通过ELISA测定培养基中的IL6。单个点代表独立实验（Mito，n个 = 4、电动汽车、，n个 = 5). 条形图显示平均值 ± SD.单向方差分析。

**图7。Parkin激活抑制EV内线粒体蛋白的内含。**
一AA处理诱导MDV形成。盖玻片上生长的WT MEF在无AA（蓝色）或有AA的情况下培养1 h（红色）。然后量化mtHSP70和TOM20 MDV。每个数据点代表一个单元格。条形图表示至少三个独立实验中至少30个细胞的平均值 ± SD.双面t吨-测试。b条,**c（c）**损伤诱导的MDV靶向溶酶体。b条WT MEF被视为(一)在存在E64/Pepstatin和MDV与溶酶体标记物LAMP1相关的情况下，量化为与LAMP1有关的MDV总数的分数。或者(**c（c）**)根据OPA1 KO MEF对LAMP1阳性MDV进行量化。每个数据点代表一个单元格。条形图表示至少三个独立实验中至少20个细胞的平均值 ± SD.双面t吨-测试）。d日GFP-Parkin的稳定表达增加了MDV的形成。用AA处理稳定表达GFP（蓝色）或GFP-Parkin（红色）的U2OS细胞4次 h和MDV量化。每个数据点代表一个单元格。条形图表示至少三个独立实验中至少20个细胞的平均值 ± SD单向方差分析。**e（电子）**mtHSP70 MDV与Parkin相关。稳定转染GFP-Parkin的U2OS细胞按(d日)以及通过免疫荧光定量的mtHSP70 MDV的相关性。单个点代表独立实验(n个 = 4). 条形图显示总（蓝色）和Parkin阳性（绿色）mtHSP70 MDV的平均百分比 ± SD.双面t吨-测试。**（f）**GFP-Parkin表达损害IM/基质蛋白纳入EV。从稳定表达GFP（蓝色）或GFP Parkin（红色）的U2OS细胞中分离EVs，并测量如图所示的指示线粒体蛋白。1。单个点代表独立的实验(n个 = 3，TOM20除外，其中n个 = 4). 条形图显示平均值±SD。双面t吨-测试。

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[8] van Niel G、D’Angelo G、Raposo G。细胞外囊泡的细胞生物学研究。自然修订版分子细胞生物学。2018;19:213–228. doi:10.1038/nrm.2017.125。-内政部-公共医学

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