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.2021年3月26日；12(4):326.
doi:10.1038/s41419-021-03494-1。

MIRLET7BHG通过外体SMO激活肝星状细胞触发Hedgehog通路促进肝细胞癌进展

夏云红 # 1, 陆珍 # 2, 李红霞 # 三, 王朔敏 4, 孙晨 4, 王崇冲 4, 杨晓宇 4
附属机构

MIRLET7BHG通过外体SMO激活肝星状细胞触发Hedgehog通路促进肝细胞癌进展

夏云红等。 细胞死亡病. .

摘要

肝细胞癌（HCC）通常由肝纤维化引起，是一个发病率高的全球性挑战。肝星状细胞（HSC）的激活有助于肝纤维化。外泌体是在细胞间通讯中起重要作用的小泡。平滑（SMO）是Hedgehog通路的关键信号传感器。本研究旨在研究SMO在HSC激活中的作用及其潜在机制。功能分析包括5-乙炔基-2´-脱氧尿苷、集落形成、伤口愈合、穿孔和球体形成分析揭示了SMO的功能。外泌体生物标记物的Western blot分析、免疫荧光染色分析、电子显微镜和流式细胞术显示外泌物的存在。生物信息学分析和机械分析揭示了RNA之间的相互作用。建立裸鼠异种移植瘤模型，评价肝癌的生长情况。我们发现SMO是HCC细胞中的一个癌基因，在静止的HSC中低表达。然后，SMO在HCC细胞条件培养液培养的HSC中上调。接下来，发现HCC细胞衍生的外泌体通过向HSC传递SMO来激活HSC。随后，我们认识到微小RNA let-7b宿主基因（MIRLET7BHG）作为对抗miR-330-5p的竞争内源性RNA来上调SMO。反过来，SMO诱导刺猬途径促进GLI家族锌指1（Gli1），导致激活HSC中MIRLET7BHG的转录激活。总之，本研究证明，Gli1诱导的MIRLET7BHG通过外体SMO激活HSC来刺激hedgehog通路，从而促进HCC，为HCC治疗提供了一条新的途径。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。SMO促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT过程和干细胞特征。
A类qRT-PCR显示SMO在肝癌细胞系（Hep 3B、LM3、97H和Huh-7）和HSC细胞系（LX2）中的表达水平。B类qRT-PCR验证了SMO在LM3和97H细胞中的耗尽效率。C类–D类EdU（条形值 = 100 μm）和集落形成实验表明，无论SMO是否耗尽，HCC细胞的增殖均呈阳性。E类伤口愈合试验显示，无论SMO是否下调，HCC细胞的迁移能力（bar 价值= 80 微米）。F类–G公司Transwell分析显示肝癌细胞对SMO沉默的迁移和侵袭能力（bar值 = 50 微米）。H（H）Western blot检测转染sh-NC或sh-SMO#1/2的肝癌细胞中E-cadherin、N-cadherin，OCT4和Nanog的表达。我球体形成实验显示SMO沉默后HCC细胞的球体形成效率（bar值 = 50 μm）*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.
图2
图2。HCC细胞衍生的外泌体传递SMO并激活HSC。
A类qRT-PCR检测LM3或97H细胞条件培养液（CM）诱导的静止HSC和活化HSC中SMO的表达。B类Western blot检测LM3或97H来源的外泌体中CD9、HSP70、CD81和TSG101的蛋白水平。C类电子显微镜显示了外泌体的图像。D类IF染色分析显示，经LM3/97H细胞外显体处理的LX2细胞中存在PKH67标记的外显体（bar值 = 15 微米）。E类qRT-PCR检测经LM3-或97H-衍生外体处理的LX2细胞中SMO的表达。F类Western blot分析显示在不同浓度的外泌体处理下LX2细胞中α-SMA和FAP的蛋白水平。G公司–J型EdU、集落形成、伤口愈合和transwell分析测试了LX2细胞的细胞增殖、迁移和侵袭，无论是否使用LM3或97H-衍生的外泌体。K（K）Western blot分析静止的LX2细胞和外泌体激活的LX2细胞中E-cadherin、N-cadherin，OCT4和Nanog的水平。L（左）球体形成实验揭示了LM3-或97H-衍生外体对LX2细胞干的影响**P（P） < 0.01.
图3
图3。SMO促进活化HSC的增殖、迁移、侵袭、EMT和干细胞。
A类–B类EdU（条形值 = 100 μm）和集落形成分析显示，无论是否敲除SMO，外泌体激活的HSC都会增殖。C类–E类.伤口密封（bar值 = 80 μm）和transwell分析（bar值 = 50 μm）揭示了沉默SMO对外泌体激活HSC迁移和侵袭能力的影响。F类Western blot检测外显体激活的HSC细胞中E-cadherin、N-cadherin，OCT4和Nanog的水平，无论是否存在SMO缺陷。G公司球体形成测定（棒值 = 50 μm）揭示了沉默SMO对激活HSC干细胞的影响**P（P） < 0.01.
图4
图4。MIRLET7BHG海绵状miR-330-5p上调SMO。
A类RNA下拉分析检测了生物素标记的SMO对miR-326和miR-330-5p的富集。B类qRT-PCR检测miR-330-5p在活化HSC中的过度表达效率。C类qRT-PCR显示上调miR-330-5p对活化HSC中SMO表达的影响。D类利用starBase数据库预测SMO与miR-330-5p的结合位点。E类荧光素酶报告分析检测了miR-330-5p过度表达后激活的HSC中野生型和突变SMO荧光素酶活性的变化。F类RNA下拉分析显示生物素标记的miR-330-5p富集了四种潜在的lncRNA。G公司qRT-PCR测定了静止和激活HSC中MIRLET7BHG的表达。H（H）qRT-PCR验证了MIRLET7BHG的耗尽效率，并评估了沉默的MIRLET7 BHG对激活HSC中SMO表达的影响。我LncLocator数据库和亚细胞组分分析揭示了MIRLET7BHG在活化HSC中的亚细胞定位。J型通过starBase数据库预测了MIRLET7BHG和miR-330-5p之间的结合位点。K（K）RNA下拉分析显示，生物素标记的miR-330-5p拉下的MIRLET7BHG富集。L（左）RIP分析抗Ago2组相对于抗IgG组MIRLET7BHG、miR-330-5p和SMO的富集情况。M（M）荧光素酶报告子分析检测了miR-330-5p过表达下野生型和突变型MIRLET7BHG荧光素酶活性的变化**P（P） < 0.01，“n.s”表示无意义。
图5
图5。MIRLET7BHG通过上调SMO激活HSC。
在不同转染下有四组活化的HSC：sh-NC、sh-MIRLET7BHG#1、sh-MIR LET7BOG#1+pcDNA3.1/NC和sh-MIRLET7BHG#1+pcDNA A3.1/SMO。A类Western blot检测各组α-SMA和FAP蛋白水平。B类–C类EdU和集落形成分析检测了不同环境下活化HSC的增殖。D类–E类伤口愈合和穿孔实验分析了不同组的细胞迁移和侵袭能力。F类–G公司Western blot和球体形成分析分析了EMT过程中的变化以及所示转染后活化HSC的干细胞**P（P） < 0.01.
图6
图6。Gli1转录激活MIRLET7BHG。
A类qRT-PCR显示沉默SMO对MIRLET7BHG表达的影响。B类荧光素酶报告子分析揭示了当SMO受到下调时MIRLET7BHG启动子的荧光素酶活性。C类Western blot在指定组中测试了刺猬路径相关蛋白（SMO和Gli1）。D类qRT-PCR验证了Gli1的过表达效率以及上调Gli1对MIRLET7BHG表达的影响。E类qRT-PCR检测了Gli1的敲除效率以及下调的Gli1对MIRLET7BHG表达的影响。F类萤光素酶报告基因测定分析了在Gli1上调或不上调的活化HSC中MIRLET7BHG启动子的萤光素酶活性。G公司Gli1的DNA基序和Gli1在MIRLET7BHG启动子上的两个结合位点。H（H）ChIP分析显示抗Gli1组相对于对照抗IgG组MIRLET7BHG启动子富集。我荧光素酶报告子分析确定了Gli1过度表达对具有指示的MIRLET7BHG启动子（野生型、位点1突变型、位点2突变型或位点1/2突变型）的报告子荧光素酶活性的影响*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01，“n.s”表示无意义。
图7
图7。SMO通过Hedgehog途径介导HSC激活。
有三组不同处理的活化HSC：sh-NC、sh-MIRLET7BHG#1和sh-MIRLET7BHG#1+SAG。A类–B类EDU和集落形成分析评估了SAG对MIRLET7BHG缺乏影响的细胞增殖的拯救作用。C类–D类伤口愈合和穿孔实验监测不同组的细胞迁移和侵袭。E类–F类Western blot和球体形成分析评估SAG对激活HSC中MIRLET7BHG耗竭-抑制EMT和干细胞的影响**P（P） < 0.01.
图8
图8。SMO通过激活HSC促进体内肿瘤生长。
A类–B类不同组的肿瘤体积和重量。C类IHC染色测定不同组肿瘤中Ki-67和PCNA阳性（bar值 = 50 微米）。D类概念图：Gli1诱导的MIRLET7BHG通过外体SMO激活HSC来触发Hedgehog途径，从而促进肝癌的发展**P（P） < 0.01.
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