Cardiomyocyte depolarization triggers NOS-dependent NO transient after calcium release, reducing the subsequent calcium transient

doi:10.1007/s00395-021-00860-0

.2021年3月17日；116(1):18.

doi:10.1007/s00395-021-00860-0。

心肌细胞去极化在钙释放后触发NOS依赖性NO瞬态，减少随后的钙瞬态

Matias Mosqueira公司^#^1 2, 罗兰·科涅茨尼^#^三 4, 卡罗琳·安德森^三 4 5 6, 王超（Chao Wang）^三 4 7, 雷纳·H·A·芬克⁴

附属机构

¹德国海德堡海德堡大学医院生理与病理生理研究所心肺通气肌肉生理实验室，Im Neuenheimer Feld 326，R.305，69120。matias@physicalogie.uni-heidelberg.de。
²德国海德堡大学医院生理学和病理生理学研究所医学生物物理室，邮编69120。matias@physicalogie.uni-heidelberg.de。
^三德国海德堡海德堡大学医院生理与病理生理研究所心肺通气肌肉生理实验室，Im Neuenheimer Feld 326，R.305，69120。
⁴德国海德堡大学医院生理学和病理生理学研究所医学生物物理室，邮编69120。
⁵德国海德堡干细胞技术和实验医学研究所（HI-Stem gGmbH）。
⁶德国海德堡德国癌症研究中心（DKFZ）干细胞与癌症部。
⁷中国湖北省武汉市第一医院心血管科。

^#贡献均等。

采购管理信息： 33728868
PMCID公司： PMC7966140型
内政部： 2007年10月7日/00395-021-00860-0

心肌细胞去极化在钙释放后触发NOS依赖性NO瞬态，减少随后的钙瞬态

马蒂亚斯·莫斯奎拉等。基础研究心脏病学. 2021.

.2021年3月17日；116(1):18.

doi:10.1007/s00395-021-00860-0。

作者

马蒂亚斯·莫斯奎拉^#^1 2, 罗兰·科尼特兹尼^#^三 4, 卡罗琳·安德森^三 4 5 6, 王超（Chao Wang）^三 4 7, 雷纳·H·A·芬克⁴

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¹德国海德堡海德堡大学医院生理与病理生理研究所心肺通气肌肉生理实验室，Im Neuenheimer Feld 326，R.305，69120。matias@physicalogie.uni-heidelberg.de。
²德国海德堡大学医院生理学和病理生理学研究所医学生物物理室，邮编69120。matias@physicalogie.uni-heidelberg.de。
^三德国海德堡海德堡大学医院生理与病理生理研究所心肺通气肌肉生理实验室，Im Neuenheimer Feld 326，R.305，69120。
⁴德国海德堡大学医院生理学和病理生理学研究所医学生物物理室，邮编69120。
⁵德国海德堡干细胞技术和实验医学研究所（HI-Stem gGmbH）。
⁶德国海德堡德国癌症研究中心（DKFZ）干细胞与癌症部。
⁷中国湖北省武汉市第一医院心血管科。

^#贡献均等。

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内政部： 2007年10月7日/00395-021-00860-0

摘要

一氧化氮（NO）是由三种一氧化氮合酶（NOS）中的一种产生的，它集中调节心脏兴奋-收缩耦合、代谢和信号活动。尽管NO在心脏钙中起着重要作用²⁺在不同的病理生理条件下，如杜氏肌营养不良（DMD），没有精确的方法描述no的产生、来源或作用，通过两条no信号通路：可溶性鸟苷酸环化酶-蛋白激酶G（no-sGC-PKG）和S-亚硝化（SNO）。我们采用一种新的策略，即用一种对NO高度特异的铜基染料负载分离的小鼠心肌细胞，在每次电刺激事件后观察到一个单一的瞬时NO生成信号。在Rhod-2 Ca开始后67.5 ms，NO瞬态信号开始²⁺短暂信号，持续约430毫秒。特定NOS亚型阻滞剂或NO清除剂显著抑制NO瞬变，表明野生型（WT）心肌细胞产生nNOS依赖的NO瞬变。相反，DMD小鼠模型mdx心肌细胞中的NO瞬态依赖于诱导型NOS（iNOS）和内皮细胞（eNOS）。在连续刺激方案中，WT心肌细胞中的nNOS依赖性NO瞬态显著降低下一个Ca²⁺通过NO-sGC-PKG的瞬态。在mdx心肌细胞中，这种抑制作用依赖于iNOS和eNOS，并通过SNO途径发生。WT心肌细胞基础NO的生成依赖于nNOS和iNOS，mdx心肌细胞则依赖于eNOS和i NOS。这些结果表明，心肌细胞在毫秒级膜去极化时产生NO亚型依赖性瞬态，激活特定的信号通路，对随后的Ca²⁺瞬态。

关键词：钙瞬变；心肌细胞；杜兴肌营养不良；氟-4；MDX；不开；一氧化氮；罗德-2。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

数字

图1
一个分离心肌细胞的荧光成像。负载Rhod-2（10µM，45分钟）的分离心肌细胞一用543 nm的激光波长激发，在551至701 nm之间检测到发射，而心肌细胞负载NO-ON染料（10µM，持续2 h）b在488nm处激发，并使用共焦激光扫描显微镜（图像大小：512）在497-537nm之间检测到发射 × 512像素，像素大小：0.186µm）。黄线代表记录的心肌细胞中的线扫描区域。**c（c）**,d日同时记录Ca的六次连续行扫描的平均图像（5632行，512像素，800行/秒，8秒总行扫描）²⁺和心肌细胞沿黄线的NO瞬变一,b。黄色虚线表示在开始记录后2秒和刺激后6秒，每行扫描进行一次电刺激（20 V，10 ms，0.167 Hz）的时刻。**e（电子）**归一化荧光强度，F类₁/F类₀两个Ca的²⁺平均线扫描的（红色）和NO（绿色）轨迹**c（c）**,d日时间刻度以横坐标表示，纵坐标表示归一化荧光强度F类₁/F类₀入口显示了图中所示轨迹的NO瞬态放大**e（电子）**虚线表示基线恢复到电刺激前的水平。图S1显示了六次单线扫描的单个轨迹

图2
分离心肌细胞中肌营养不良蛋白和一氧化氮合酶的免疫印迹。从每个基因型的五个小鼠心脏分离的心肌细胞中提取蛋白质。每个泳道使用75微克蛋白质在4-12%凝胶上进行肌营养不良蛋白（约427 kDa）的免疫印迹分析(一)10%凝胶上的nNOS（约161 kDa）(b)，iNOS（约133 kDa），10%凝胶(**c（c）**)10%凝胶上的eNOS（约130 kDa）(d日)和GAPDH（约36 kDa）在10%凝胶上(**e（电子）**). 对归一化强度信号进行非参数统计分析，并使用GAPDH的原始强度作为负载控制(**e（电子）**). **第页 < 0.01.纳秒无显著差异

图3
内源性NO生成的基线值和AUC值。在对照溶液（含我-精氨酸200µM），并使用NO清除剂PTIO（200µM）进行处理(一). 记录道处和2.0 s之前的粉红色范围符号表示用于分析基线的大约200 ms区域。入口以蓝色显示第六个NO瞬态曲线（AUC）下的分析区域。所有六条记录道（第一条至第六条）均采用彩色编码，并在记录道右侧进行识别。荧光强度在纵坐标处以任意单位表示，时间在横坐标处以s表示。b–**e（电子）**标准化基线的箱线图(b,d日)和AUC(**c（c）**,**e（电子）**)WT NO瞬变纵坐标上以中值任意单位（m.a.u.）表示的值(b,**c（c）**)和mdx(d日,**e（电子）**)心肌细胞。基线(**（f）**)和AUC(克)基因型之间的比较。在含有200µM的对照溶液中溶解不同药物的作用下分离的心肌细胞我-精氨酸（横坐标）：对照组（灰色）、5 mM L-NAME（红色）、100 nM SMTC（绿色）、1µM 1400 W（蓝色）、1μM L-NIO（橙色）和200µM PTIO（紫色）。箱线图显示了每个基因型从五只小鼠获得的每个治疗组分析的心肌细胞数量。与相应对照组的比较：*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001. 关于准确的数据值，标准化基线值见表S1，AUC值见表S2

图4
最后六个连续NO和Ca²⁺WT心肌细胞的瞬变。任意单位中六个非标准化连续NO瞬态的代表性迹线(一,**c（c）**,**e（电子）**,克)和钙²⁺瞬变（nM）(b,d日,**（f）**,小时)从WT分离的心肌细胞中记录。一,克NO瞬态和b,小时钙²⁺控制溶液中记录的瞬态信号。**c（c）**NO瞬态信号和d日钙²⁺从用非特异性NOS阻断剂L-NAME（5mM）孵育的WT分离的心肌细胞记录的瞬态信号。**e（电子）**NO瞬态和**（f）**钙²⁺用NO清除剂PTIO（100µM）培养的WT-分离心肌细胞记录的瞬态信号。Ca下方的灰色虚线²⁺瞬态轨迹用作基线的视觉参考。每个瞬态都是用20 V、10 ms和0.67 Hz触发的(一–**（f）**)和1赫兹(克,小时)底部用黑色箭头指示的现场电刺激

图5
内源性NO对连续钙的影响²⁺瞬态。10个校准和连续Ca中的最后6个²⁺在每个NOS亚型的特定阻滞剂作用下的瞬态。将分离的心肌细胞加载10µM Fluo4-AM，电刺激（20 V，10 ms，2.0 Hz），并从光电倍增管放大信号中以2 Kb/s的速度记录。Ca的规模²⁺纵坐标显示瞬时浓度（20 nM），横坐标显示时间（1.5 s）。一WT-分离心肌细胞Ca²⁺显示了在控制溶液（黑色）、5 mM L-NAME（红色）和100 nM SMTC（绿色）存在下记录的瞬态。连续Ca²⁺在含有200µM的对照溶液中mdx心肌细胞的瞬态我-精氨酸（点黑色）或溶解在含有200µM的对照溶液中的不同药理剂我-精氨酸（横坐标）如下所示：5 mM L-NAME（点红色）和1µM 1400 W（点蓝色）(b)和对照溶液（黑色虚线）、5 mM L-NAME（红色虚线）和1µM L-NIO（橙色虚线）(**c（c）**).d日,**e（电子）**横坐标和最后五个连续Ca上AUC百分比的量化²⁺WT心肌细胞纵坐标处的瞬态d日和mdx心肌细胞**e（电子）**.第五Ca²⁺瞬态被认为是第一个Ca²⁺待分析的瞬态，因此占AUC的100%。图例旁边显示了从每个基因型的五只小鼠中获得的每种治疗中分析的心肌细胞数量。与相应控制瞬态的比较：L-NAME**第页 < 0.01和***第页 < 0.001; 表面张力控制^¶¶¶第页 < 0.001; 1400瓦^###第页 < 0.001; L-NIO公司⁺⁺⁺第页 < 0.001. 有关准确的数据值，请参见表S3

图6
最后六个连续Ca的AUC量化²⁺在NO信号通路的特定激活剂或阻断剂存在下WT和mdx心肌细胞的瞬态。用10µM Fluo4 AM加载分离的心肌细胞，电刺激（20 V，10 ms，2.0 Hz），并以2 Kb/s的速度从光电倍增管放大的信号中记录。这些数据与对照溶液（黑色）对比，参照面板之间显示的NO信号通路上的点。一,**c（c）**,**e（电子）**,克WT-分离心肌细胞AUCs的定量b,d日,**（f）**,小时mdx分离的心肌细胞。一与对照溶液（黑色）相比，sGC阻滞剂ODQ（10µM，红色）和ODQ与5 mM L-NAME（绿色）的组合的效果。b10µM BAY-412272（绿色）以及BAY-412252和5 mM L-NAME（棕色）组合的效果。**c（c）**PKG阻滞剂KT5823（10µM，汽油）和KT5823-5 mM L-NAME（橙色）组合的效果。d日PKG活化剂8pCPT（10µM，橙色）以及8pCPT-5 mM L-NAME（红色）组合的效果。**e（电子）**影响*S公司*-亚硝化清除剂NEM（20µM，棕色）以及NEM和5 mM L-NAME在WT心肌细胞中的组合。**（f）**影响*S公司*-亚硝化清除剂NEM（20µM，汽油）和NEM与5 mM L-NAME（红色）在mdx心肌细胞中的组合。克,小时1 mM抗坏血酸（AA）对*S公司*-WT心肌细胞中的亚硝化（灰色）和5 mM L-NAME（深红色）。小时1 mM AA对mdx心肌细胞S-亚硝基化（深蓝色）和与5 mM L-NAME（深红色）联合作用的影响。图例旁边显示了从每个基因型的五只小鼠中获得的每种治疗中分析的心肌细胞数量。符号*、**和***表示第页 < 0.05,第页 < 0.01和第页 < 与对照组相比，单次治疗分别为0.001。符号#、##和###表示第页 < 0.05,第页 < 0.01和第页 < 与对照组相比，联合治疗组分别为0.001

图7
NOS依赖NO瞬态及其对Ca的影响的示意图²⁺瞬态。在存在肌营养不良蛋白的正常心肌细胞（左侧；WT）中，nNOS和iNOS负责舒张NO的生成，而nNOS负责收缩NO的瞬态。NO瞬变是在膜去极化（红色）后产生的，它通过减少下一个Ca来发挥作用²⁺通过sGC-PKG信号通路的瞬态。在营养不良的心肌细胞（右侧；mdx）中，营养不良蛋白的缺失降低了nNOS的表达和活性，增强了iNOS，从而调节了舒张期NO的生成。在收缩期，iNOS和eNOS负责下一个Ca的NO瞬态改变²⁺通过SNO修改的瞬态

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1. Balligand JL，Feron O，Dessy C.eNOS通过体力激活：从收缩的短期调节到心血管组织的慢性重塑。《生理学评论》，2009年；89:481–534. doi:10.1152/physrev.00042.2007。-内政部-公共医学
1. Balligand JL、Ungureanu-Longrois D、Simmons WW、Pimental D、Malinski TA、Kapturczak M、Taha Z、Lowenstein CJ、Davidoff AJ、Kelly RA等。心肌细胞中细胞因子诱导的一氧化氮合酶（iNOS）表达。体外单个心肌细胞iNOS表达的特征和调节以及iNOS活性的检测。生物化学杂志。1994;269:27580–27588. doi:10.1016/S0021-9258（18）47024-X。-内政部-公共医学

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[5] Ashamalla SM，Navarro D，Ward CA。成年大鼠左心室壁钠电流梯度。生理学杂志。2001;536:439–443. doi:10.1111/j.1469-7793.2001.0439c.xd。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Ashamalla SM，Navarro D，Ward CA。成年大鼠左心室壁钠电流梯度。生理学杂志。2001;536:439–443. doi:10.1111/j.1469-7793.2001.0439c.xd。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Balligand JL，Feron O，Dessy C.eNOS通过体力激活：从收缩的短期调节到心血管组织的慢性重塑。《生理学评论》，2009年；89:481–534. doi:10.1152/physrev.00042.2007。-内政部-公共医学

[8] Balligand JL，Feron O，Dessy C.eNOS通过体力激活：从收缩的短期调节到心血管组织的慢性重塑。《生理学评论》，2009年；89:481–534. doi:10.1152/physrev.00042.2007。-内政部-公共医学

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