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.2021年4月6日；10（7）：e019310。
doi:10.1161/JAHA.120.019310。 Epub 2021年3月15日。

雌激素在Rab9依赖性线粒体自噬、延缓动脉衰老中起关键作用

佐佐木裕一 1, 池田佳彦 1, 内藤义弘 1, 赤崎裕一 1, 佐岛纯一 2, Mitsuru Ohishi先生 1
附属公司

雌激素在Rab9依赖性线粒体自噬中发挥关键作用，延缓动脉衰老

佐佐木裕一等。 J Am心脏协会. .

摘要

众所周知，绝经后心血管疾病的风险增加。线粒体通过线粒体自噬进行质量控制，在细胞衰老的调节中起着至关重要的作用。本研究的目的是研究雌激素介导的动脉衰老保护作用是否归因于线粒体自噬的诱导。方法和结果我们使用人脐静脉细胞、血管平滑肌细胞和12周龄雌性C57BL/6小鼠。细胞给予17β-雌二醇（E2）可抑制细胞衰老和线粒体功能障碍。此外，E2增加线粒体自噬，维持线粒体功能，延缓细胞衰老。值得注意的是，E2并没有调节LC3（轻链3），而ATG7（自噬相关7）缺陷并没有抑制E2处理细胞中的线粒体自噬。相反，E2增加了Rab9与LAMP2（溶酶体相关膜蛋白2）信号的共定位。通过敲除Ulk1或Rab9，E2介导的线粒体自噬效应被消除。这些结果表明E2介导的线粒体自噬与Rab9依赖的选择性自噬相关。E2上调了SIRT1（sirtuin 1）和激活的LKB1（肝激酶B1）、AMPK（腺苷单磷酸活化蛋白激酶）和Ulk1，表明E2对Rab9依赖性选择性自噬诱导的作用是通过SIRT1/LKB1/AMPK/Ulkl途径介导的。与假手术小鼠相比，卵巢切除小鼠表现出线粒体自噬减少，线粒体功能障碍和动脉衰老加速；E2政府成功地挽救了这些有害的改变。结论E2诱导的线粒体自噬在延缓血管衰老中起关键作用。依赖于Rab9的选择性自噬是E2诱导的线粒体自噬的基础。

关键词：自噬；雌激素；线粒体；血管衰老。

PubMed免责声明

利益冲突声明

没有。

数字

图1
图1。雌激素治疗延缓细胞衰老并维持HUVEC和VSMC的线粒体功能。
A类，显示了SA‐βgal染色的代表性图像。SA‐βgal‐阳性细胞随着细胞传代的增加而增加。E2（10 nmol/L）可减少SA‐βgal‐阳性细胞。比例尺=50μm*P（P）<0.01 vs E2（−）（每组n=5）。使用双向方差分析进行统计分析。B类显示了p53、PAI‐1和β‐actin的免疫印迹和定量分析结果。E2处理的细胞与未处理的细胞相比，p53和PAI‐1的蛋白表达较低*P（P）<0.05 vs E2（−）（每组3个）。C类图中显示了E2（10 nmol/L）+ICI 182780（1μmol/L）处理的第5代细胞SA‐βgal染色的代表性图像。ICI的施用减弱了E2介导的细胞衰老延迟。比例尺，50μm*P（P）<0.01 vs E2（每组n=5）。D类，使用JC-1评估线粒体膜电位。红色表示保持膜电位的线粒体，而绿色表示去极化线粒体。显示了带去极化线粒体的HUVEC和VSMC的定量。比例尺，50μm*P（P）<0.01 vs E2（HUVECs，n=3/组；VSMCs，n=5/组）。E类，左侧面板：TMRE染色用于评估线粒体膜电位。红色表示维持膜电位的极化线粒体。比例尺，50μm。右图：线粒体活性氧用MitoSox Red进行评估。线粒体活性氧作为红色信号的水平在E2处理的细胞中较低（每组4个）。比例尺，25μm。F类，H2O（运行）2使用Amplex红试验评估经E2或不经E2处理的HUVEC和VSMC的产量*P（P）<0.01（HUVECs，每组n=3；VSMCs，每组n=4）。所有数据均显示为平均值±SEM。E2表示17β-雌二醇；人脐静脉内皮细胞；PAI‐1，纤溶酶原激活物抑制剂‐1；活性氧；SA‐βgal，衰老相关β‐半乳糖苷酶；四甲基罗丹明乙酯；血管平滑肌细胞。
图2
图2。E2诱导的线粒体自噬。
A类，在含有或不含有E2的HUVECs和VSMCs中线粒体自噬的电子显微镜分析（上图，比例尺=1μm）。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示（比例尺=500 nm）。每组细胞从3个独立的实验中随机选择，并计数被自噬体吞噬的线粒体数量。在E2处理的细胞中，每个细胞吞噬线粒体的自噬体/自溶体数量较高*P（P）<0.01 vs E2（−）。B类，带有或不带有E2的HUVEC和VSMC中LAMP2（绿色）和TOMM20（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。E2处理的细胞中合并黄色信号的数量较高。比例尺=10μm*P（P）<0.01 vs E2（−）。C类，显示LC3和p62的免疫印迹和定量分析结果。两组之间的LC3和p62无差异（n=3/组）。D类，左面板：含或不含E2的VSMC中LC3（绿色）和LAMP2（红色）免疫组化的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。两组合并黄色信号的数量没有差异。比例尺=10μm。右面板：伴有或不伴有E2的VSMC中LC3（绿色）和TOMM20（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。两组合并黄色信号的数量没有差异。比例尺=10μm。E、，转染siATG7或siControl的E2或载体治疗的VSMC中LAMP2（绿色）和TOMM20（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。分别用载体或E2处理的siATG7和siControl转染的VSMC中合并黄色信号的数量没有差异。不适用。；不重要。使用双向方差分析进行统计分析。比例尺=10μm。F、，E2或用siATG7或siControl转染的载体处理的VSMCs中线粒体自噬的电子显微镜分析（上图，比例尺，1μm）。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示（比例尺=500 nm）。每组细胞从3个独立的实验中随机选择，并计算自噬体吞噬的线粒体数量。分别用载体或E2处理的siATG7和siControl转染的VSMC中吞噬线粒体的自噬体/自溶体数量没有差异。不适用。；不重要。使用双向方差分析进行统计分析。所有数据均显示为平均值±SEM。E2表示17β-雌二醇；人脐静脉内皮细胞；LAMP2，溶酶体相关膜蛋白2；LC3，轻链3；线粒体外膜转座酶TOMM20 20；血管平滑肌细胞。
图3
图3。E2诱导的Rab9依赖性替代性自噬。
A类，带有或不带有E2的HUVEC和VSMC中LAMP2（绿色）和Rab9（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。E2处理的细胞中合并黄色信号的数量较高*P（P）<0.01 vs E2（−）。比例尺=10μm。B类用电子显微镜分析转染siRab9或siControl的E2处理的VSMC的线粒体自噬（上面板和中面板分别为刻度条，1μm）。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示（比例尺，500 nm）。每组细胞从3个独立的实验中随机选择，并计算自噬体吞噬的线粒体数量。在转染siRab9的E2处理细胞中，每个细胞吞噬线粒体的自噬体/自溶体数量较低*P（P）与siControl相比<0.01。C类，转染siRab9的E2处理的VSMC中LAMP2（绿色）和Rab9（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。转染siRab9的E2处理细胞中Rab9信号和合并黄色信号的数量较低。比例尺，10μm*P（P）与siControl相比<0.01。D类，用siRab9转导的E2处理的VSMC中LAMP2（绿色）和TOMM20（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。在转染siRab9的E2处理细胞中，合并黄色信号的数量较低。比例尺，10μm*P（P）与siControl相比<0.01。E类、转染siUlk1的E2处理的VSMC中LAMP2（绿色）和Rab9（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。转染siUlk1的E2处理细胞中Rab9信号和合并黄色信号的数量较低。比例尺，10μm*P（P）与siControl相比<0.01。所有数据均显示为平均值±SEM。E2表示17β-雌二醇；人脐静脉内皮细胞；LAMP2，溶酶体相关膜蛋白2；TOMM20，线粒体外膜转位酶20；血管平滑肌细胞。
图4
图4。SIRT1调节E2介导的依赖Rab9的选择性自噬。
A类显示了SIRT1的免疫印迹和定量分析结果。E2处理的细胞与未处理的细胞相比，SIRT1蛋白表达更高*P（P）<0.05 vs E2（−）**P（P）<0.01 vs E2（−）（每组3个）。B类图中显示了E2处理的HUVEC和VSMC的代表性免疫印迹和定量分析结果，包括或不包括ICI 182780（1μmol/L）。ICI 182780降低SIRT1的蛋白表达*P（P）<0.05 vs E2（+）（HUVEC，n=3/组；VSMC，n=4/组）。C类图中显示了E2处理的HUVEC加或不加G15（20μmol/L）的代表性免疫印迹和定量分析结果。G15没有改变SIRT1的蛋白表达（每组4个）。D类，显示了E2（10 nmol/L）+sirtinol（50μmol/L）处理的细胞SA‐βgal染色的代表性图像。服用西地诺后，SA‐βgal‐阳性细胞数量增加。比例尺，50μm*P（P）<0.05 vs E2（+）（每组n=5）。E类，E2处理的VSMC中线粒体自噬的电子显微镜分析，含或不含sirtinol（上面板，比例尺，1μm）。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示（比例尺，500 nm）。每组细胞从3个独立的实验中随机选择，并计算自噬体吞噬的线粒体数量。在用西丁醇处理E2的细胞中，吞噬每个细胞线粒体的自噬体/自溶体数量较低*P（P）<0.01 vs E2（+）。F类，E2处理的维他命醇处理的VSMC中LAMP2（绿色）和Rab9（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。在E2处理的细胞中，用西地诺处理的Rab9信号和合并黄色信号的数量较低。比例尺，10μm*P（P）<0.01 vs E2（+）。G公司，E2处理的西尔蒂诺VSMC中LAMP2（绿色）和TOMM20（红色）免疫组织化学的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。在用西罗蒂诺醇处理的E2细胞中，合并的黄色信号的数量较低。比例尺，10μm*P（P）<0.01 vs E2（+）。所有数据均显示为平均值±SEM。E2表示17β-雌二醇；人脐静脉内皮细胞；LAMP2，溶酶体相关膜蛋白2；SA‐βgal，衰老相关β‐半乳糖苷酶；SIRT1，sirtuin 1；TOMM20，线粒体外膜转位酶20；血管平滑肌细胞。
图5
图5。SIRT1/LKB1/AMPK/Ulk1轴参与选择性自噬的诱导。
A类，有或没有E2治疗的VSMCs中LKB1、AMPK、Ulk1和Rab9的代表性免疫印迹和定量分析。E2处理激活LKB1、AMPK、Ulk1和Rab9*P（P）<0.05 vs E2（−）（每组3个）。B类在E2处理的含或不含西替诺的VSMC中，对LKB1、AMPK、Ulk1和Rab9进行代表性免疫印迹和定量分析。服用西地诺可减弱E2对LKB1、AMPK、Ulk1和Rab9的激活*P（P）<0.05 vs E2（+）（每组3例）。C类用或不使用化合物C（10μmol/L）对E2处理的VSMC进行AMPK、Ulk1和Rab9的代表性免疫印迹和定量分析。化合物C的给药减弱了E2对AMPK、Ulk1和Rab9的激活*P（P）<0.05 vs E2（+）（每组3例）。D类，化合物C（10μmol/L）E2处理的VSMC中Rab9（红色）免疫组化的代表性图像。在3个独立实验的背景下，每组评估30个细胞。在E2处理的细胞中，使用化合物C标尺（10μm）的Rab9信号数量较低*P（P）<0.01 vs E2（+）。所有数据均显示为平均值±SEM。AMPK表示一磷酸腺苷活化蛋白激酶；E2，17β-雌二醇；LAMP2，溶酶体相关膜蛋白2；肝激酶B1；SIRT1，sirtuin 1；血管平滑肌细胞。
图6
图6。OVX通过减少线粒体自噬促进动脉衰老。
C57BL/6小鼠接受OVX或假手术。A类，手术后8周使用Masson三色染色评估假手术和OVX小鼠的主动脉纤维化。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示。OVX小鼠的纤维化面积更大。比例尺，25μm*P（P）<0.05 vs假手术组（每组3例）。B类，4‐HNE在假手术和OVX小鼠中的代表性图像。与假手术小鼠相比，4‐HNE在OVX小鼠主动脉中的免疫反应性增加。C类，相对H2O（运行）2采用Amplex红试验评估假手术小鼠和OVX小鼠术后8周主动脉分离线粒体的生成。H（H）2O（运行）2OVX小鼠的产量较高*P（P）<0.05 vs假手术组（每组3例）。D类，假手术和OVX小鼠中Ac‐p53和p53的代表性免疫印迹和定量分析。Ac‐p53在OVX小鼠中的表达高于假手术小鼠*P（P）与假手术组相比<0.05（每组n=4）。E类，假手术小鼠和OVX小鼠主动脉的电子显微镜图像（上面板，比例尺，1μm）。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示（比例尺，500 nm）。大于900μm2随机筛选每只小鼠的主动脉；对每组3个样本进行评估，并计算被自噬体吞噬的线粒体数量。OVX小鼠线粒体自噬数量较低*P（P）<0.05 vs假手术。F类，假手术小鼠和OVX小鼠主动脉LAMP2（绿色）和TOMM20（红色）免疫组化的代表性图像。OVX小鼠的合并黄色信号较低。比例尺，5μm*P（P）<0.05 vs假手术组（每组3例）。G公司、假手术小鼠和OVX小鼠中Ulk1和Rab9的代表性免疫印迹和定量分析。与OVX小鼠相比，假手术小鼠激活的Ulk1和Rab9的表达更高*P（P）<0.05 vs假手术组（每组4例）。H（H），假手术小鼠和OVX小鼠主动脉LAMP2（绿色）和Rab9（红色）免疫组化的代表性图像。OVX小鼠的黄色信号数量较低。比例尺，5μm*P（P）<0.05 vs假手术组（每组3例）。我、假手术和OVX小鼠中LC3和p62的代表性免疫印迹和定量分析。两组间LC3和p62的表达无差异（每组4个）。所有数据均显示为平均值±SEM。4‐HNE表示4‐羟基壬醛；LAMP2，溶酶体相关膜蛋白2；LC3，轻链3；卵巢切除术；和TOMM20，线粒体外膜转位酶20。
图7
图7。雌激素通过诱导线粒体自噬来挽救OVX诱导的动脉衰老。
将E2或对照颗粒植入OVX小鼠8周。A类，植入8周后使用Masson三色染色法评估OVX和OVX+E2小鼠的主动脉纤维化。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示。OVX+E2小鼠的纤维化面积较小。比例尺，25μm*P（P）与OVX相比<0.05（每组n=3）。B类，4‐HNE在OVX和OVX+E2小鼠中的代表性图像。与OVX+E2小鼠相比，OVX小鼠主动脉中4-HNE的免疫反应性增加。C类，相对H2O（运行）2植入8周后，用Amplex红试验评估OVX和OVX+E2小鼠主动脉分离线粒体的生成。H（H）2O（运行）2OVX+E2小鼠的产量较低*P（P）<0.05 vs OVX（每组3例）。D类OVX和OVX+E2小鼠中Ac‐p53和p53的代表性免疫印迹和定量分析。Ac‐p53在OVX+E2小鼠中的表达低于OVX小鼠*P（P）<0.05 vs假手术组（每组3例）。E类，OVX和OVX+E2小鼠主动脉的电子显微镜图像（上面板，比例尺，1μm）。虚线矩形所描绘区域的放大图像如下所示（比例尺，500 nm）。大于900μm2随机筛选每只小鼠的主动脉；对每组3个样本进行评估，并计算被自噬体吞噬的线粒体数量。OVX+E2小鼠线粒体自噬数量较高*P（P）与OVX相比<0.05。F类，在OVX和OVX+E2小鼠中LAMP2（绿色）和TOMM20（红色）免疫组织化学的代表性图像。合并的黄色信号在OVX+E2小鼠中较高。比例尺，5μm*P（P）<0.05 vs OVX（每组3例）。G公司，LAMP2（绿色）和Rab9（红色）免疫组织化学在OVX和OVX+E2小鼠中的代表性图像。合并的黄色信号在OVX+E2小鼠中较高。比例尺，5μm*P（P）<0.05 vs OVX（每组3例）。H（H）OVX和OVX+E2小鼠中Ulk1和Rab9的代表性免疫印迹和定量分析。激活的Ulk1和Rab9在OVX+E2小鼠中的表达高于OVX小鼠*P（P）与假手术组相比<0.05（每组n=3）。我、OVX和OVX+E2小鼠中总OXPHOS的代表性免疫印迹和定量分析。两组间总OXPHOS的表达无差异（n=3/组）。J型，评估植入8周后OVX和OVX+E2小鼠主动脉分离线粒体的相对ATP生成。OVX+E2小鼠的ATP生成量较高*P（P）<0.05 vs OVX（每组3例）。所有数据均显示为平均值±SEM。4‐HNE表示4‐羟基壬醛；E2，17β-雌二醇；LAMP2，溶酶体相关膜蛋白2；卵巢切除术；氧化磷酸化；以及线粒体外膜20的转座酶TOMM20。
图8
图8。雌激素延缓动脉衰老作用的拟议机制。
雌激素增加线粒体自噬，有助于线粒体质量控制和延缓细胞衰老。依赖Rab9的选择性自噬，而非传统自噬是E2诱导的线粒体自噬的主要形式。E2对Rab9诱导的影响由SIRT1/LKB1/AMPK/Ulk1途径介导。因此，来源于SIRT1/LKB1/AMPK/Ulk1/Rab9介导的选择性自噬的线粒体自噬在雌激素延缓血管衰老的作用中起着关键作用。AMPK表示一磷酸腺苷活化蛋白激酶；ATG7，自噬相关7；E2，17β-雌二醇；LC3，轻链3；肝激酶B1；活性氧；和SIRT1，sirtuin 1。
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中的注释

  • 性激素在心血管疾病中的作用。
    Lim英国。 Lim英国。 Nat Rev Cardiol公司。2021年6月；18(6):385. doi:10.1038/s41569-021-00551-2。 Nat Rev Cardiol公司。2021 PMID：33828253 没有可用的摘要。

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