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.2021年2月19:12:598959。
doi:10.3389/fphar.2021.598959。 eCollection 2021年。

过度表达激活转录因子3减轻大鼠心肌微血管缺血/再灌注损伤

Yi Liu（刘毅） 1 2 三 4, 胡一森 1 2 三 4, 熊敬杰 1 2 三 4, 曾晓聪 1 2 三 4
附属公司

激活转录因子3的过表达减轻大鼠心脏微血管缺血/再灌注损伤

Yi Liu（刘毅）等。 Front Pharmacol公司. .

摘要

激活转录因子3（ATF3）已被证实对氧化应激反应，并对Toll样受体4（TLR4）的活性进行负调控。然而，ATF3对心脏微血管缺血/再灌注（I/R）损伤的影响尚不清楚。利用GEO2R在线工具在两个大鼠I/R损伤微阵列数据集中获得差异表达基因GSE4105和GSE122020。我们建立了大鼠心肌I/R模型体内，还生成了在体外心肌母细胞H9c2细胞缺氧/复氧（H/R）模型.通过腺病毒介导的基因转移（Ad-ATF3）实现ATF3的过度表达。大鼠随机分为四组：假手术组、I/R组、I/R+Ad-Lacz组（作为对照组）和I/R+Ad-ATF3组。ELISA、CCK-8、DCFH-DA探针、qRT-PCR和Western blotting检测ATF3的表达、氧化指数、细胞损伤和TLR4/NF-κB通路相关蛋白。透射电镜、免疫组织化学和免疫荧光检测白细胞浸润和微血管形态和功能的改变体内也获得了超声心动图和血流动力学数据。生物信息学分析显示，在两个独立的大鼠心肌I/R模型中，I/R心肌中ATF3上调。心脏微血管I/R损伤包括白细胞浸润、微血管完整性破坏和微血管灌注缺陷，最终导致血流动力学参数和心功能恶化。Ad-ATF3显著恢复微血管功能，增加心脏微血管灌注，改善血流动力学参数和心功能。从机制上讲，Ad-ATF3改善了I/R心肌中的氧化应激，抑制了TLR4/NF-κB通路的激活，并下调了下游促炎细胞因子的表达体内和H/R H9c2细胞在体外ATF3过表达通过抑制TLR4/NF-κB通路和氧化应激，部分保护心脏微血管I/R损伤。

关键词：缺血/再灌注；激活转录因子3；炎症反应；微血管损伤；氧化应激；toll样受体4。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
图1
实验方案示意图（A）重组腺病毒（100 ul，1×109pfu）通过心肌内注射直接进入心室。三天后，对大鼠进行1小时的心肌缺血和6小时的再灌注（B）H9c2细胞被Ad-ATF3或Ad-LacZ感染。72 h后，H9c2细胞缺氧6 h，再复氧3 h，诱导h/R损伤。
图2
图2
生物信息学分析确定了与心肌I/R大鼠模型相关的两个独立基因表达数据集中的二甘醇（A和B）热图表示两个基因表达数据集（GSE4105和GSE122020）中生物信息学分析的筛选结果。用标准化基因表达值表示I/R组与对照组的DEGs水平。每行表示一个DEG，每个示例表达式值由一个矩形表示。颜色分级表示基因表达的强度：红色表示最高表达，蓝色表示最低表达。I/R损伤心肌中ATF3显著增加（C）显示GSE4105和GSE122020中常见DEG的维恩图，包括ATF3、OLR1、SERPINE和IL6。
图3
图3
ATF3过表达抑制H/R H9c2细胞TLR4/NF-κB通路的激活（A和H）通过蛋白质印迹检测细胞核和细胞质部分中ATF3、TLR4的表达水平以及IκBα、NF-κB p65的磷酸化（B和D）用qRT-PCR测定H9c2细胞ATF3和TLR4的mRNA水平（C、E-G、I-L）中每个蛋白质带的定量A和H使用ImageJ软件进行。细胞质和核蛋白的强度分别归一化为GADPH和Lamin B*第页< 0.05, **第页<0.01。n=6/组。
图4
图4
ATF3过表达抑制H9c2细胞H/R诱导的炎症、氧化应激和细胞损伤（A–C）用qRT-PCR法检测H9c2细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平（D–F）用ELISA试剂盒测定H9c2细胞中促炎细胞因子、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平（G–J）用DCFH-DA探针测定细胞内ROS生成，用ELISA试剂盒测定H9c2细胞中MDA、SOD和GSH-Px的水平（K，L）CCK-8检测细胞活力。使用细胞毒性试剂盒测定LDH*第页< 0.05, **第页<0.01。n=6/组。
图5
图5
ATF3过表达抑制I/R心肌TLR4/NF-κB通路的激活（A）Western blotting检测细胞核和细胞质组分中ATF3、TLR4、IκBα磷酸化、NF-κB p65的表达水平（B、D、H–J）qRT-PCR法检测心肌ATF3、TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平（C、E–G）使用ImageJ软件量化A中的每个蛋白带。细胞质和核蛋白的强度分别归一化为GADPH和Lamin B（K–M）ELISA法测定血清促炎细胞因子、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平（N–Q）用ELISA试剂盒测定血清ROS、MDA、SOD和GSH-Px水平*第页< 0.05, **第页<0.01。n=8/组。
图6
图6
ATF3过表达抑制I/R心肌白细胞浸润（A和B）免疫荧光法检测微血管中ICAM-1的表达。每组在至少五个随机选择的区域中观察到至少10个微血管管腔（C和D）免疫组织化学检测微血管中VCAM-1的表达。每组在至少五个随机选择的区域中观察到至少10个微血管管腔（E和F）中性粒细胞用F4/80染色，心肌用cTnT免疫荧光染色。F4/80和cTnT的克隆化代表迁移到心肌的中性粒细胞（G和H）中性粒细胞用MPO免疫组织化学染色。每组在高密度区域内观察到至少五个随机选择的区域*第页< 0.05, **第页<0.01.8/组。
图7
图7
ATF3过表达维持I/R损伤大鼠的微血管屏障（A和E）采用VE-cadherin和CD31双重免疫荧光染色检测内皮屏障完整性。免疫荧光显示，IR导致VE-cadherin表达中断，ATF3过度表达可改善这种中断（B）的表达式级别第页-eNOS由Western blots测定（D）通过ImageJ软件量化B。蛋白质带的强度归一化为GADPH（C）TEM显示微血管内皮粘附连接的超微结构。下部面板是上部面板矩形区域的放大图像，表示细胞接触和电子密集区域（皮层蛋白复合体）（G）细胞间连接的电子密集区与细胞间接触总长度的比值（F和H）免疫组化染色血浆白蛋白，检测微血管通透性。在I/R期间，血浆白蛋白从微血管泄漏到心肌组织中，ATF3过度表达使其减弱*第页< 0.05, **第页<0.01。n=8/组。
图8
图8
ATF3过表达改善I/R大鼠心脏微血管灌注（A）HE染色显示微血管阻断后红细胞聚集和形态学变化（B、C和D）透射电镜观察微血管内皮和管腔面积。ATF3过度表达可改善I/R诱导的EC肿胀和肥大，导致管腔狭窄（E和F）明胶墨水染色检查微血管灌注缺损。I/R引起微血管阻塞，ATF3过表达使其减弱*第页< 0.05, **第页<0.01。n=8/组。
图9
图9
在I/R损伤大鼠中ATF3过度表达可减小梗死面积，改善血流动力学指标和心功能（A和G，H）通过超声心动图测定左心室功能（A），包括EF（G）和FS（H） （B、I-L）将右颈动脉插管至左心室，以测定血流动力学参数。每只大鼠左心室压力的代表性轨迹如所示（B）.血流动力学指标，包括LVSP（一）、LVEDP（J）和±dp/dtmax（K，L），使用MPA心功能系统软件进行分析（C和D）进行Evans Blue和TTC染色以确定梗死面积（C）计算心肌梗死面积与面积风险比（IA/AAR）（D） （E和F）CK-MB水平（E）和cTnT（F）使用ELISA测定大鼠血清中的*第页< 0.05, **第页<0.01。n=8/组。
图10
图10
示意图显示ATF3过度表达可减轻心脏微血管I/R和H/R损伤。TLR4被I/R和H/R激活，并触发IκBα磷酸化和NF-κB p65核移位，随后上调下游促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和VCAM-1）的表达。另一方面，ROS介导的氧化应激发生在I/R和H/R中。这些激活通过降低VE粘附素的含量和增加通透性来破坏内皮细胞之间的连接。腺病毒介导的ATF3过表达通过抑制TLR4/NF-κB通路的激活、改善氧化应激、改善心脏微血管I/R损伤和心脏功能来减轻I/R或H/R诱导的损伤。
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