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.2021年3月5日；7(1):24.
doi:10.1038/s41523-021-00227-7。

REPLICANT灌注液的蛋白质组学检测转移淋巴结微环境的变化

朱莉娅·史蒂文森 1, 雷切尔·巴罗·麦基 1, 陆羽 2, 安吉拉·保罗 2, 戴维·曼斯菲尔德 三, 朱莉·欧文 4, 娜塔莉·伍德曼 4, 雷切尔·纳特拉扬 1, 赛义德·海德尔 1, 谢丽尔·吉列 4, 安德鲁·塔特 1, 莎拉·平德 5, Jyoti Choudary公司 2, 卡尼沙·奈杜 6 7
附属机构

REPLICANT灌注液的蛋白质组学检测转移淋巴结微环境的变化

朱莉娅·史蒂文森等。 NPJ乳腺癌. .

摘要

在乳腺癌（BC）中，术前检测低容量腋窝淋巴结（ALN）转移是一项困难的工作，需要新的生物标记物。我们最近表明，患者来源的ALN可以通过常温灌注在体外维持。我们现在通过结合全断面多重免疫荧光和TMT标记的循环灌流液的LC-MS/MS来比较反应性（无瘤；n=5）和大转移性（含肿瘤沉积>2mm；n=4）ALN。大转移瘤中的B细胞和T细胞（CD4）明显较少+/CD8（CD8）+/监管），而非反应性节点（p=0.02）。同样，灌注液蛋白质组的通路分析（119/1453个蛋白质显著差异表达）表明，大转移患者的免疫功能降低，有利于“细胞外基质降解”；只保留了中性粒细胞脱颗粒。灌注液蛋白质组与淋巴结阳性胰腺癌和前列腺癌的定性比较也强调了“中性粒细胞脱颗粒”是淋巴结转移的一个促成因素。因此，可以检测到复制灌注液蛋白质组中由转移诱导的变化，并有助于发现生物标记物。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。复制腋窝淋巴结（ALN）的多重免疫荧光。
反应性(n个 = 5） 和大转移(n个 = 4） 对ALN进行CD8、CD4、CD20、FoxP3和PD-L1荧光染色；反应性节点，适用于CD68；转移性淋巴结，另外还有泛细胞角蛋白（pan-CK）。反应式的典型图像(A类)和大转移(B类)显示节点（x20倍放大；视野：670 微米 × 500 微米）。从左到右，第一个面板显示免疫荧光染色；第二个面板显示了通过算法生成的细胞表型图。在转移性淋巴结中，组织也被分割（B类)分为主要包含癌细胞的区域（“肿瘤”；红色）、基质区域（“肿瘤”；浅灰色）和主要包含淋巴细胞的区域（“淋巴细胞”；绿色），用于肿瘤浸润淋巴细胞（mTIL）和PD-L1分析。在对照组（基线时固定）和灌注淋巴结（反应性淋巴结显示在C类，转移于D类; 电池密度 = 总电池数/mm2; Wilcoxon试验）。因此，仅对灌注的ALN进行后续分析。mTIL在转移性ALN（“空洞肿瘤”）的整个组织切片中，以及在“肿瘤”、“间质”和“淋巴”区域中的百分比如图所示E类(n个 = 4). 这些地区之间的差异具有统计学意义(第页 < 0.0001; Kruskal-Wallis试验）。然而，调节性T细胞（T-regs）的区域分布没有显著差异(F类). PD-L1（平均信号强度）与其他细胞标记物的共同定位如所示G公司0.49%（整个肿瘤）和30-54%（局部）的PD-L1染色没有与我们染色的任何其他标记物（“其他免疫”）共存。大部分剩余信号出现在T淋巴细胞上（36%（整个肿瘤）；32%（肿瘤）；46%（基质）；37%（淋巴）），其中癌细胞占总强度的5%至10%，B细胞<5%。H（H）CD20的平均细胞密度 + B细胞(第页 = 0.02），CD8 + T细胞(第页 = 0.02），CD4 + T细胞(第页 = 0.02）和T-regs(第页 = 0.02）在被大转移瘤替代的淋巴结中显著减少（后者为Kruskal–Wallis；前三者为Mann–Whitney）。（图表显示平均值和平均值标准误差（SEM））。
图2
图2。对119个显著差异表达的蛋白质进行层次聚类分析，将反应性蛋白质从转移性淋巴结中分离出来。
热图显示了九个灌注液样本（取自九个不同患者）的层次聚类。反应性淋巴结和转移性淋巴结明显分离。
图3
图3。灌注液蛋白质组反映了其来源的腋窝淋巴结（ALN）的病理生理学。
反应性ALN中57个显著上调的蛋白(A类;n个 = 5） 大转移性ALN中62个显著上调的蛋白(B类;n个 = 4） 在ConsensusPathDB中进行通路分析。反应性ALN维持免疫功能，但在大转移性淋巴结中失去免疫功能，“中性粒细胞脱颗粒”明显例外。大转移淋巴结中“角化”的识别反映了淋巴结中存在癌细胞。这些节点中确定的其他途径与细胞外基质（ECM）降解有关。组织学中性粒细胞计数（苏木精和伊红染色的ALN组织切片）如所示(C类; 图表显示了平均值和平均值的标准误差（SEM））。
图4
图4。灌注液蛋白质组与原发性乳腺癌（BC）和血浆蛋白质组的比较产生了新的数据。
我们根据腋窝肿瘤负担（ATB）将TCGA（CPTAC）初级BC蛋白质组数据分为三组：仅进行前哨淋巴结活检（SLNB；无/低ATB）的患者；完成检查的患者（CC；ATB负担高于SLNB组）；以及那些在诊断时有腋窝淋巴结清扫和高ATB的患者（ALND）。在10种最丰富的反应蛋白中，ADD1(第页 = 0.01;A类)和特定的ADD1磷酸亚型；ASPN公司(第页 = 0.02;B类)和PRELP(第页 = 0.023;B类)SLNB组显著上调，与我们的数据相符。没有发现转移蛋白有显著差异表达。灌注液蛋白质组与BC血浆蛋白质组研究的比较(C类)显示最小重叠，APOC3和KRT9在转移性淋巴结/灌注液中表达上调，SERPIND1在反应性淋巴结或灌注液中上调。（图中显示了具有四分位范围的中位数）。
图5
图5。当复制蛋白组与胰腺癌或前列腺癌进行比较时，中性粒细胞脱颗粒反复出现。
灌注蛋白质组与淋巴结阳性胰腺导管腺癌独家比较中获得的常见表达蛋白的通路分析(A类; 515种常见表达蛋白）或结节阳性前列腺癌(B类; 854种常见表达蛋白）中性粒细胞脱颗粒一直被认为对淋巴结转移很重要。
图6
图6。中性粒细胞脱颗粒和48个“核心蛋白”在肿瘤的淋巴结转移中是保守的。
同时将复制蛋白组与结节阳性胰腺癌和结节阳性前列腺癌进行比较，确定438个常见表达蛋白。这438个蛋白质的通路分析如所示A类“中性粒细胞脱颗粒”再次被确定为对淋巴结转移很重要。某些蛋白家族也在三个数据集中重复出现（48个“核心蛋白”）。这些“核心蛋白”的通路分析如所示B类.
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