Dynamic Na+/H+ exchanger 1 (NHE1) - calmodulin complexes of varying stoichiometry and structure regulate Ca2+-dependent NHE1 activation

doi:10.7554/eLife.60889

.2021年3月3日3:10:e60889。

doi:10.7554/eLife.60889。

动态Na⁺/H（H）⁺交换剂1（NHE1）-不同化学计量比和结构的钙调蛋白复合物调节钙²⁺-依赖性NHE1激活

Lise M Sjögaard富^#¹, 安德烈亚斯·普雷斯特尔^#², 艾米莉·斯佩德森², 马克·塞韦林¹, 克里斯蒂安·科尔比·克里斯滕森^三 4, 约翰·奥尔森², 出生B克拉格伦², 斯汀·法西格·佩德森¹

附属机构

¹丹麦哥本哈根大学理学院生物系细胞生物学和生理学系。
²丹麦哥本哈根大学科学院生物系结构生物学和核磁共振实验室。
^三丹麦哥本哈根Rigshospitalet芬森实验室。
⁴哥本哈根大学生物技术研究与创新中心（BRIC），丹麦哥本哈根。

^#贡献均等。

采购管理信息： 33655882
PMCID公司： PMC8009664型
内政部： 10.7554/eLife.60889

动态Na⁺/H（H）⁺交换剂1（NHE1）-不同化学计量比和结构的钙调蛋白复合物调节钙²⁺-依赖NHE1激活

Lise M Sjögaard富等。埃利夫. 2021.

.2021年3月3日3:10:e60889。

doi:10.7554/eLife.60889。

作者

附属机构

¹丹麦哥本哈根大学科学院生物系细胞生物学和生理学科。
²丹麦哥本哈根大学科学院生物系结构生物学和核磁共振实验室。
^三丹麦哥本哈根Rigshospitalet芬森实验室。
⁴哥本哈根大学生物技术研究与创新中心（BRIC），丹麦哥本哈根。

^#贡献均等。

采购管理信息： 33655882
PMCID公司： PMC8009664型
内政部： 10.7554/eLife.60889

摘要

钙调素（CaM）参与钙²⁺-与许多蛋白质的依赖性相互作用，包括与人钠的物理和功能相互作用仍不完全了解⁺/H（H）⁺-交换器NHE1。利用核磁共振（NMR）光谱、等温滴定量热法和稳定表达野生型和突变型NHE1的成纤维细胞，我们发现这种功能重要的复合物存在于不同的NHE1:CaM化学计量学和结构中的多个可访问状态。我们确定了CaM连接两个NHE1细胞溶质尾部的三元络合物的NMR溶液结构。体外化学计量和亲和力可以通过NHE1:CaM比率和钙（[Ca²⁺])以及通过第一个CaM结合α-螺旋中S648的磷酸化。细胞内Ca²⁺-CaM诱导的NHE1活性通过模拟S648磷酸化和第一个CaM结合α-螺旋的突变而降低，而Akt的抑制不影响其活性，Akt是磷酸化S648的几种激酶之一。我们的结果表明NHE1:CaM相互作用模式的多样性，并表明CaM可能有助于NHE1二聚化，从而增强NHE1的调节。我们认为类似的结构多样性与许多其他CaM复合体有关。

关键词：钙信号；核磁共振；Na+/H+交换器；SLC9A1；细胞生物学；人；分子生物物理学；磷酸化；结构生物学；结构。

PubMed免责声明

利益冲突声明

LS、AP、EP、MS、KK、JO、BK、SP未宣布竞争利益

数字

图1。 — **图1..Na⁺/H（H）⁺-交换剂：钙调素（NHE1:CaM）相互作用*在体外*采用不同的化学计量方法。**
(一)膜中NHE1（蓝色）的草图，突出细胞质尾部的螺旋元素和已知的磷酸化位点（红星）。放大区域描绘了两个先前描述的CaM-结合（CB）α-螺旋CB1（绿色）和CB2（紫色）与磷酸化S648。(b)人类、小鼠、大鼠、蝾螈、斑马鱼和鲨鱼NHE1序列的对齐以灰色的相同残基突出显示。以上所示为基于Agadirα-螺旋预测的结构和功能区域，如Köster等人2011年定义的CaM-结合区域A（绿色）和区域B（紫色），或如Bertrand等人1994年定义的钙结合区域I（CB1）和II（CB2）。(**c（c）**)-(**e（电子）**).通过等温滴定量热法（ITC）将NHE1与CaM结合。在典型的ITC实验中，我们注入(**c（c）**)NHE1型_622-657或(d日)NHE1型_651-692或(**e（电子）**)NHE1型_{622年至692年}转化为CaM。上部显示了滴定的基线校正原始数据，下部显示了归一化综合结合等温线，拟合的结合曲线假设在(d日)和中的两个绑定事件(**c（c）**)和(**e（电子）**). 滴定成CaM的NHE1肽如卡通所示。

图2。 — **图2钙调蛋白（CaM）与NHE1的相互作用_622-657（H1）和NHE1_651-692（H2）。**
(一)¹H、，¹⁵50μM的N HSQC光谱¹⁵仅N-CaM（黑色）且存在125μM未标记NHE1_622-657（H1，绿色）。(b)放大中光谱中的三个高亮区域(一);¹H、，¹⁵50μM的N个HSQC光谱¹⁵存在0μM（黑色）、50μM（红色虚线）和125μM（绿色）未标记NHE1时的N-CaM_622-657水平和垂直比例尺对应0.1 ppmδ¹H和0.5 ppmδ¹⁵N、分别是。(**c（c）**)随着NHE1数量的增加，CaM交互的卡通表示_622-657. (d日)CaM与NHE1相互作用时的化学位移扰动（CSP；ΔδNH）_622-657饱和时（125μM NHE1_622-657，50微米¹⁵N-CaM，表示为2:1 NHE1:CaM）。(**e（电子）**)¹H、，¹⁵50μM的N HSQC光谱¹⁵N-CaM单独（黑色）和存在（紫色）未标记NHE1_651-692. (**（f）**)放大光谱中高亮显示的三个区域(**e（电子）**);¹H、，¹⁵N HSQC光谱¹⁵用未标记的NHE1滴定0至125μM（黑色至紫色）的N-CaM_651-692（H2）。水平和垂直比例尺对应0.1 ppmδ¹H和0.5 ppmδ¹⁵N、分别是。(克)随着NHE1数量的增加，CaM交互的卡通表示_651-692. (小时)CaM与NHE1相互作用时的CSP（ΔδNH）_651-692饱和时（125μM NHE1_651-692，50微米¹⁵N-CaM）。异核单量子相干；二甲基亚砜；RMSD——根-平方偏差；NOE——核overhauser效应；牛血清白蛋白；十二烷基硫酸钠；IPTG-异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；DSS-2,2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸钠。

**图2-图补充1。提取结合动力学的TITAN 2D核磁共振线型分析。**
(一)测量（左）和模拟（右）的侧面比较¹H、，¹⁵50μM钙调蛋白（CaM）的N HSQC光谱(¹³C类^,15N）用高达125μM的未标记NHE1滴定_622-657。通过将数据拟合到四状态模型（如下图所示），并使用以下参数获得模拟光谱*k个_远离的*从拟合和*K（K）_d日*s取自等温滴定量热分析。(b)测量（左）和模拟（右）的侧面比较¹H、，¹⁵50μM CaM的N HSQC光谱(¹³C类^,15N）用高达125μM的未标记NHE1滴定_651-692。通过将数据拟合到下图所示的具有参数的两态模型，可以获得模拟光谱*k个_远离的*和*K（K）_d日*从拟合中获得。模拟光谱中的黑线连接了中的四个或两个状态的拟合信号位置(一)和(b)分别是。

图2——图补充2。 — **图2-图补充2.滴定¹⁵带有未标记钙调蛋白（CaM）的N标记H1、H2和H1H2。**
(一) ¹H、，¹⁵100μM的N HSQC光谱¹⁵N-NHE1型_622-657用高达300μM（黑色到绿色）的未标记CaM滴定。L639在三种不同NHE1下的核磁共振信号_622-657：CaM比率；1:1（顶部）、1:2（中部）和1:3（底部）显示在右侧。N和C表示高亮显示的残基是否与CaM的N或C叶结合。弱交换峰值表示中等/慢速交换（约0.1 s⁻¹)NHE1的_622-657在实验期间，在两个CaM叶之间。漫画描绘了最流行的NHE1_622-657：CaM状态是[CaM]增加的函数。(b)¹H、，¹⁵50μM的N HSQC光谱¹⁵N-NHE1型_651-692用未标记的CaM滴定至200μM（黑色至紫色）。D657的核磁共振位移显示在右侧，化学位移扰动作为CaM浓度的函数，产生一个*K（K）_D类*4.6±0.6μM。漫画描绘了最流行的NHE1_651-692：CaM状态是[CaM]增加的函数。(**c（c）**)¹H、，¹⁵100μM的N HSQC光谱¹⁵N-NHE1型_622-692在50μM未标记CaM存在下。信号严重展宽和重叠，但共振与H1光谱中的信号非常相似，H1与CaM（绿色）或游离H2（蓝色）的两个叶相结合，证实了右图所示的1:2（CaM:H1）复合物。(d日)¹H、，¹⁵100μM的N个HSQC光谱¹⁵N-NHE1型_622-692在存在100μM未标记CaM的情况下。这些信号与H1的频谱与CaM的N瓣（绿色）的共振非常相似，很少有信号与游离H2的远C端区域（蓝色）的共振相似，这证实了右图所示的1:1（CaM:H1）复合物。(**e（电子）**)缩放¹H、，¹⁵N HSQC光谱强调H1（R647，顶行）和H2（HεNεW663，底行）的典型共振。漫画描述了给定条件下最流行的NHE1:CaM状态。dl表示双标签(¹³C、，¹⁵N） ●●●●。

图2——补充图3。 — **图2-图补充3.Na核磁共振化学位移的浓度依赖性⁺/H（H）⁺-交换器（NHE1）H2。**
¹H、，¹⁵NHE1 H2在不同浓度下的N HSQC光谱显示出化学位移的浓度依赖性变化，表明肽在高浓度下的弱自结合。突出显示了受影响最大的共振，对应于NHE1残基E661–N664的延伸。

图3。 — **图3钙调蛋白（CaM）与NHE1的相互作用_622-692（H1H2）在两种不同的化学计量中。**
(一)1:2 CaM:NHE1_622-692（H1H2）络合物（摩尔比1:2）。三个区域¹H、，¹⁵50μM的N HSQC光谱¹⁵N-CaM与125μM NHE1_622-657（绿色），125μM NHE1_651-692（紫色），或125μM NHE1_622-692（橙色）。水平和垂直比例尺对应0.1 ppmδ¹H和0.5 ppmδ¹⁵N、分别是。产生所示峰值的络合物如下图（右和左）所示，中心为1:2络合物。(b)1:2 CaM:NHE1之间的化学位移扰动（CSP）（ΔδNH）_622-692复合物和1:2 CaM:NHE1_622-657复合物（深红色和绿色光谱一). 灰色阴影表示CaM的连接区域。(**c（c）**)1:2 CaM:NHE1之间的CSP（ΔδNH）_622-692和1:1 CaM:NHE1_651-692（深红色和紫色光谱一). (d日)1:1 CaM:NHE1_622-692复杂。三个区域¹H、，¹⁵50μM的N HSQC光谱¹⁵125μM NHE1存在下的N-CaM_622-657年（绿色），125μM NHE1_652-692（紫色），或50μM NHE1_622-692（橙色）。水平和垂直比例尺对应0.1 ppmδ¹H和0.5 ppmδ¹⁵N、分别是。较小的卡通代表1:2 CaM:NHE1_622-657复合物（左侧）和1:1 CaM:NHE1_651-692复合物（右侧）和1:1 CaM:NHE1_622-692从重叠峰中识别出的复合物¹H、，¹⁵N HSQC光谱。(**e（电子）**)1:1 CaM:NHE1之间的CSP（ΔδNH）_622-692和1:2 CaM:NHE1_622-657（橙色和绿色光谱d日). (**（f）**)1:1 CaM:NHE1之间的CSP（ΔδNH）_622-692)和1:1 CaM:NHE1_651-692（橙色和紫色光谱(d日). 化学位移可在BMRB加入代码34521中获得。(克)40μM脉冲场梯度核磁共振扩散测量¹⁵不含配体的N-CaM（黑色），含40μM NHE1_622-692（1:1，橙色）和80μM NHE1_622-692（1:2，红色）。(小时)在所有三种情况下，在总蛋白浓度为1 mg/mL的情况下，通过动态光散射得到的平均粒径分布。(我)尺寸排除色谱法与游离CaM（黑色，*校准过程中的牛血清白蛋白）和CaM:H2（橙色）1:1络合物的多角度光散射洗脱曲线相耦合。

图3——图补充1。 — **图3补充图1：化学计量比为1:1（CaM:H1H2）的少数人群。**
缩放的代表区域¹H、，¹⁵钙调素（CaM）与H1（绿色）、H2（紫色）或H1H2以1:1（橙色）的化学计量比络合物的N HSQC光谱。在H1H2的情况下，信号急剧变宽，表明在这些条件下不同状态之间的构象交换。从这些状态之间的信号强度分布来看，溶液中的主状态H1与N瓣结合（62G的橙色和绿色峰重叠），H2与C瓣结合（135G的橙色与紫色峰重叠）。然而，目前的少数群体同意相反的结构，其中H1与C-叶结合，H2与N-叶结合。底部的卡通描绘了两个1:1的建筑群，它们与这些建筑相一致。

图3——图补充2。 — **图3图补遗2乙二胺四乙酸（EDTA）对钙调蛋白（CaM）与NHE1相互作用的影响_622-692.**
(一)在缺乏钙的情况下²⁺在添加过量NHE1 H1H2后，观察到小的化学位移扰动和apo-CaM的谱线展宽，表明NHE1:CaM络合物的形成也可以在没有Ca的情况下发生²⁺. (b)在钙的存在下²⁺和过量的EDTA，游离CaM从Ca中剥离²⁺从绿色的相似性可以看出¹H、，¹⁵N个HSQC光谱(一)和(b). NHE1 H1H2增加Ca²⁺CaM的C叶的亲和力，因此溶液中的主要可观察状态具有与apo状态（G26和G62）非常相似的N叶共振，而C叶共振类似于C叶与Ca结合的状态²⁺和H1（G99和G135）。

图4。 — **图4钙调蛋白（CaM）和两个钠之间的三元络合物⁺/H（H）⁺-交换器（NHE1）H1s。**
(一)该综合体的卡通，以灰色显示CaM的两个叶，以绿色显示NHE1 H1的两个螺旋。钙²⁺离子以洋红色显示。(**b、 c（c）**)计算的系综的10个最低能量结构的叠加(b)NHE1 H1绑定的CaM N瓣或(**c（c）**)CaM C叶与第二个NHE1 H1结合，显示CaM连接器周围的流动性。(**d、 e（电子）**)NHE1 H1疏水残留物与CaM形成接触(d日)N瓣和(**e（电子）**)C叶。钙之间的静电互补²⁺-CaM和NHE1-H1在(**（f）**)CaM N叶和(克)由CaM的表面电势和(**h、我**)对于两个相应绑定的H1螺旋（PDB登录代码6zbi）。

图4——图补充1。 — **图4-图补充1。晶体结构（PDB:2ygg）和核磁共振（NMR）结构的比较（PDB:6zbi）。**
(一)1:1钠的晶体结构⁺/H（H）⁺-交换器：钙调蛋白（NHE1:CaM）复合体（PDB代码：2ygg），N瓣与H2结合，C瓣背面与H1结合（PBD代码：6zbi）。(b)与中的相同(一)含有晶格中的一个对称相关分子（红色），表明CaM C叶的疏水缝隙被该对称相关复合物（H1）的H1占据_{sym（对称）}). (**c（c）**)与H1结合的CaM N叶结构（NMR结构，左）、与H1相连的CaM C叶结构（核磁共振结构，左中）、与H1相连的CaM-C叶结构的侧面比较_{sym（对称）}（晶体结构，右中），CaM N瓣与H2结合（晶体结构（右））。H1与CaM叶的疏水裂结合的三种结构与C非常相似^α-2.3º（N瓣+H1）的RMSD_核磁共振：C瓣+H1_核磁共振)，1.8Å（N瓣+H1_核磁共振：C瓣+H1_{对称，X射线})和1.1°（C叶+H1_核磁共振：C瓣+H1_{对称，X射线})分别是。

图5。 — **图5.S648磷酸化状态调节钙²⁺-依赖性钠⁺/H（H）⁺-交换器（NHE1）激活。**
(一)稳定表达野生型（WT）或变异型hNHE1的PS120细胞的代表性免疫荧光（IF）图像，并对NHE1（红色）和DAPI（蓝色）进行染色，以评估NHE1表达和定位。在倒置的Olympus Cell Vivo IX83显微镜上以60倍放大率拍摄图像，并放大标有白色方块的区域。比例尺代表20μm(n=5）。所有细胞系中钙调蛋白（CaM）的IF图像如图5补充图1所示。(b)四种变异体PS120细胞系以及未转染的PS120细胞的代表性western blot检测NHE1和内源性CaM。对于NHE1，下部带对应于未成熟蛋白，上部带对应于完全糖基化的NHE1。β-actin作为负荷控制(n=8-14）。(**c、 d日**)NHE1总量(n=11–14）或CaM(n=使用ImageJ量化8–10）的表达，并将每个变体归一化为负载对照，然后再归一化到WT NHE1细胞系中的表达。(**e（电子）**)稳定pH值_我在没有HCO的情况下，在Ringer溶液中测量_三^-对于每个细胞系。(n=4). (**f–i型**)BCECF-AM荧光转化为pH值的代表性痕迹_我对于四种NHE1变异细胞系和未转染的PS120细胞，说明pH值的时间进程_我在没有HCO的情况下在Ringer中恢复_三^-NH之后₄氯脉冲诱导酸负荷，无(**f、克**)或使用(**h、我**)加入5μM离子霉素或载体（EtOH）。回收率为∆pH*10⁻³*秒⁻¹每个细胞系的(克)(n=4-6）和(我)(*n个=* 4–6). pH值比率_我回收率表示为ΔpH/s，因为稳态pH值_我细胞系之间的酸化情况相似，可以进行直接比较。值得注意的是，变异NHE1蛋白1K3R1D3E、S648A和S648D具有自发的F395Y突变。表达和pH_我两个WT NHE1（两个不同克隆）的回收率与F395Y的回收率没有差异（图5-图补充2）。数据表示平均值±SEM(d日,克,我)用Dunnett的后验对所有细胞与WT进行单因素方差分析。对于(**c（c）**,**e（电子）**)进行Kruskal–Wallis非参数检验，将所有细胞与WT进行比较。与WT相比，各组的确切p值如下：(**c（c）**)取消转换。p=0.002，H1-CR p>0.9999，S648A p>0.999，S648D p=0.1054；(d日)取消转换。p=0.8894，H1-CR p=0.6035，S648A p=0.5309，S648D p=0.8852；(**e（电子）**)取消转换。p>0.9999，H1-CR p>0.999，S648A p>0.91999，S648D p=0.6911；(克)取消转换。p=0.0009，H1-CR p=0.7781，S648A p=0.1097，S648D p=0.7652；(我)取消转换。p=0.0007，WT车辆p=0.0254，H1-CR p=0.0089，S648A p=0.3367，S648D p=0.0195.*，*****分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。

图5——图补充1。 — **图5补充图1。稳定表达野生型（WT）或变异hNHE1的PS120细胞系中内源性钙调蛋白（CaM）的免疫荧光染色。**
稳定表达WT或hNHE1变体的PS120细胞的代表性免疫荧光图像，染色CaM（绿色）和DAPI（蓝色）以评估内源性CaM表达和定位。在Olympus Cell Vivo IX83显微镜上以60倍放大率拍摄图像，图像来自与图5a（正文）所示图像相同的细胞通道。比例尺代表20μm(*n个=* 5).

图5——补充图2。 — **图5图形补充2.表达水平和pH值的比较_我表达两种野生型（WT）和F395Y hNHE1的PS120细胞的回收率。**
左图：回收率为∆pH*10⁻³*秒⁻¹稳定表达WT-hNHE1（WT C1和C2）或具有自发F395Y突变的hNHE1的三个PS120细胞系中，该突变存在于细胞系1K3R1D3E、S648A和S648D中。在正文的所有实验中，WT C1细胞系被用作“WT”。pH值_我NH后在林格溶液中测量回收率₄氯脉冲引起的酸负荷(n=4–5). 用Dunnett的后验对细胞系与WT C1进行单因素方差分析。右：这些PS120细胞系的代表性western blot检测到Na⁺/H（H）⁺-交换器（NHE1）和内源性CaM。β-肌动蛋白用作负荷控制(n=5).

图6。 — **图6.细胞钠⁺/H（H）⁺-交换器：钙调素（NHE1:CaM）邻近性对H1-CR和S648 NHE1突变具有抵抗力，Akt和PKC活性对离子粘蛋白诱导的NHE1活性没有显著影响。**
(一)PS120细胞中野生型（WT）和变异hNHE1的近距离连接分析（PLA），添加载体（EtOH）或5μM离子霉素，如图所示(n=4–7). 阴性对照如图6补充1所示，PLA信号为洋红色，NHE1的共染色为绿色，细胞核（DAPI）为蓝色。比例尺代表20μm。(b)背景减除和细胞面积归一化后ImageJ中PLA信号的量化。每种情况下每n约有400个细胞计数(n=4). 使用Tukey的后验进行双向方差分析（ANOVA），将所有条件进行比较，结果表明各组之间没有显著差异。由于此图有45个精确的p值，可根据要求提供。(**c、 d日**)（2:1）NHE1 H1-CaM复合物的单个叶的结构，突出了突变残基和S648的位置(**c（c）**)N瓣和(d日)C叶。(**e（电子）**)回收率∆pH*10⁻³*秒⁻¹每个细胞系添加10μM Akti-1/2或载体（DMSO）(n=4). 采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey的后验来比较每个治疗组内的细胞类型。精确的p值如下：(**e（电子）**)Ctrl组：取消传输。重量p=0.0001，未转换。H1-CR p=0.0141，重量H1-CR p=0.0559；Akti-1/2组：未转换。重量p<0.0001，未转换。H1-CR p=0.0792，重量H1-CR p=0.0024。(**（f）**)如中所示(**e（电子）**)除所示细胞用5µM双吲哚甲酰胺I（BIM）或3µM Gö6983（Go）（n=4）或DMSO（载体）处理外。精确的p值如下：Ctrl-group:untransf。重量p=0.0501，重量H1-CR p=0.2291；BIM I组：未转换。重量p<0.0091，重量H1-CR p=0.0844；Go组：取消转换。重量p<0.0370，重量H1-CR p=0.1823。(克)Western blot评估Akti-1/2对表达WT和变异NHE1的PS120细胞中Akt（pAkt）Ser473与总Akt的磷酸化作用(n=4). 印迹还显示了CaM和外源NHE1的内源性水平。p150被用作负荷控制。在与Akt相同的膜上检测到NHE1和CaM。(小时)添加Akt（绿色）或蛋白激酶C（蓝色）前后NHE1-H1H2的矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析。(我)使用等温滴定量热法将Akt-磷酸化NHE1-H1H2滴定为CaM的代表性结合实验。上部显示了滴定的基线校正原始数据，下部显示了归一化积分结合等温线，拟合的结合曲线假设为双位点结合事件。滴定成CaM的肽如图所示，星号表示磷酸化的S648。数据表示平均值±SEM。*、**、***和***分别表示p<0.05、p<0.01、p<0.001和p<0.0001。

图6——图补充1。 — **图6补充图1.缺乏Na的PS120细胞缺乏邻近连接分析（PLA）信号⁺/H（H）⁺-交换器（NHE1）。**
缺乏NHE1的PS120对照细胞的代表性图像，同时使用NHE1和钙调蛋白抗体和添加载体（EtOH）或5μM离子霉素的PLA，如图所示(n=4–5). 图像对应于图6A所示的图像。PLA信号为洋红色，NHE1的共染色为绿色，细胞核（DAPI）为蓝色。如图所示，在缺乏NHE1的细胞中可以观察到可忽略的PLA信号，从而证实了分析的特异性。比例尺代表20μm。

图6——图补充2。 — **图6——图补充2：Na中磷酸化残基的鉴定⁺/H（H）⁺-核磁共振换热器（NHE1）H1H2。**
¹³C、，¹用Akt1磷酸化120小时之前（黑色）和之后NHE1-H1H2的H HSQC光谱(一，红色）或蛋白激酶C（PKC）δ(b，粉红色）。箭头强调了残基S648磷酸化后HβCβ峰的大幅偏移(一)Akt1和残留物T642、S648和T653(b)PKCδ。

图7。 — **图7.Na的动态视图⁺/H（H）⁺-交换剂：钙调素（NHE1:CaM）相互作用。**
根据[NHE1]、[CaM]和[Ca，存在多种可能的络合物²⁺]，包括三元络合物，表明CaM也可能有助于NHE1二聚。 (一)NHE1示意图，缩放CaM-结合区域。NHE1二聚体中单体的取向（N端到N端）是任意选择的。(b)CaM和NHE1的复合物及其对Ca的依赖性综述²⁺（顶部）。指数(**c–f**)请参阅下图中所示的状态。(**c（c）**)可以看到apo-CaM和NHE1之间的相互作用，但其结构未知（用问号表示）。(d日)低钙时²⁺NHE1-H1与Ca结合²⁺-负载CaM的C叶，而N叶处于其最高状态。(**e（电子）**)高Ca时²⁺水平和高NHE1:Ca²⁺-CaM比率为1:1，H1与CaM的N瓣结合，H2与CaM的C瓣结合。(**（f）**)高Ca时²⁺水平和低NHE1:Ca²⁺-CaM比率，形成1:2络合物，其中NHE1-H1与CaM的N叶和C叶结合。

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