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.2019年12月20日;9(24):e3469。
doi:10.21769/BioProtoc.3469。

体外人iPSC-衍生视网膜色素上皮细胞(iPSC-RPE)的分化

附属公司

体外人iPSC-衍生视网膜色素上皮细胞(iPSC-RPE)的分化

阿格涅斯卡·达安东尼奥·科洛诺斯卡等。 生物协议. .

摘要

诱导多能干细胞(iPSCs)是研究组织发育分子基础的良好模型系统。人iPSC-衍生视网膜色素上皮(iPSC-RPE)细胞具有胎儿样的分子特征。因此,iPSCORE等生物库包含数百个个体产生的iPSCs,是研究常见遗传变异在RPE发育过程中如何发挥作用的宝贵资源,从而导致个体成年后具有不同的年龄相关性黄斑变性(AMD)倾向。在这里,我们提出了一种优化的、成本效益高且重复性高的方案,用于在无血清条件下使用小分子衍生人类iPSC-RPE细胞,并使用流式细胞术和免疫荧光对其进行质量控制。虽然以前的大多数方案都需要费力的人工选择来富集iPSC-RPE细胞,但我们的方案使用了全培养传代,并产生了大量高纯度的iPSC-RPE细胞(88-98.1%ZO-1和MiTF双阳性细胞)。该协议的简单性和健壮性将使其能够适应涉及从数百人中生成iPSC-RPE样本的高通量应用程序。

关键词:老年性黄斑变性;分化;遗传学研究;遗传变异;人诱导多能干;人诱导多能干细胞源性视网膜色素上皮(hiPSC-RPE);视网膜色素上皮;小分子。

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利益冲突声明

竞争性利益作者声明没有竞争性利益。

数字

图1。
图1.iPSC与Dispase一起通过时玻璃血清学移液管的移动模式。
沿一个方向刮孔后,将平板顺时针或逆时针旋转90°,再次刮除剩余的iPSC菌落。大约90%的细胞应该从井中分离出来。有关详细信息,请参阅使用Dispase的iPSC通行证部分。
图2。
图2 iPSC-RPE差异协议的示意图。
烟酰胺(NIC)、Chetomin(CTM)。培养iPSC单层直到细胞达到80%的融合。iPSC-RPE分化是通过小分子(NIC和CTM)启动和驱动的。iPSC-RPE在总共12周的时间里继续差异化和扩展。整个培养传代促进iPSC-RPE细胞的扩增。改编自史密斯等人。, 2019.
图3。
图3 iPSC-RPE细胞的图像。
分化第28天(D28)iPSC-RPE细胞的亮场图像显示为多边形色素细胞的小簇,随着时间的推移而膨胀(左);第84天(D84)(左中)装有iPSC-RPE细胞(iPSCORE 87_1)的T150烧瓶;第84天iPSC-RPE样品(iPSCORE_42_1)的亮场图像显示了高度组织化的单层,具有强烈的黑色素沉着(右中)和特征性多边形形状(右)。改编自史密斯等人。, 2019.
图4。
图4 D84处iPSC-RPE细胞的图像。
离心前(左)和离心后(右)收集的iPSC-RPE细胞(iPSCORE_29_1)。
图5。
图5第84天iPSC-RPE(iPSCORE_42_1)的流式细胞术分析显示闭锁带1(ZO-1)和小脑相关转录因子(MiTF)的高度共染色。
改编自史密斯等人。,2019年.
图6。
图6 Bestrofin 1(BEST1)(iPSCORE_29_1)、ZO-1(iPSCERE_29_1)和MiTF(iPSCHRE_42_1)的免疫荧光分析。
ZO-1呈尖锐的细胞膜染色;与ZO1染色相比,BEST1膜染色显得“模糊”;MiTF核染色。改编自史密斯等人。, 2019.

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引用人

工具书类

    1. Al-Zamil W.M.和Yassin S.A.(2017年)。年龄相关性黄斑变性的最新进展:综述。临床干预年龄12:1313-1330。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Aoki H.、Hara A.、Nakagawa S.、Motohashi T.、Hirano M.、Takahashi Y.和Kunisada T.(2006年)。体外分化为RPE细胞前体的胚胎干细胞在体内发育成RPE细胞单层。2): 265-274.-公共医学
    1. Buchholz D.E.、Hikita S.T.、Rowland T.J.、Friedrich A.M.、Hinman C.R.、Johnson L.V.和Clegg D.O.(2009年)。从诱导的多能干细胞衍生出功能性视网膜色素上皮。干细胞27(10):2427-2434。-公共医学
    1. Hazim R.A.、Karumbayaram S.、Jiang M.、Dimashkie A.、Lopes V.S.、Li D.、Burgess B.L.、Vijayaraj P.、Alva-Ornelas J.A.、Zack J.A、Kohn D.B.、Gomperts B.N.、Pyle A.D.、Lowry W.E.和Williams D.S.(2017年)。RPE细胞与无整合iPS细胞的分化及其细胞生物学特性。干细胞研究与治疗8(1):217。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Idelson M.、Alper R.、Obolensky A.、Ben-Shushan E.、Hemo I.、Yachimovich-Cohen N.、Khaner H.、Smith Y.、Wiser O.、Gropp M.、Cohen M.A.、Even-Ram S.、Berman-Zaken Y.、Matzrafi L.、Rechavi G.、Banin E.和Reubinoff B.(2009年)。人类胚胎干细胞定向分化为功能性视网膜色素上皮细胞。细胞干细胞5(4):396-408。-公共医学