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.2021年2月16日；14(1):27.
doi:10.1186/s13045-021-01045-x。

YM101的构建、表达和增强抗肿瘤活性：一种同时靶向TGF-β和PD-L1的双特异性抗体

明毅（Ming Yi） 1, 张静（音译） 2, 李安平 三, 梦可牛 1 三, 阎永祥 2, 英娇 1, 罗素霞 三, 周鹏飞 4, 吴孔明博士 5 6
附属公司

YM101的构建、表达和增强抗肿瘤活性：一种同时靶向TGF-β和PD-L1的双特异性抗体

明毅（Ming Yi）等。 血液肿瘤杂志. .

摘要

背景：靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡-干扰素1（PD-L1）轴的治疗性抗体在多种癌症中诱导有效且持久的抗肿瘤反应。然而，只有一部分患者受益于抗PD-1/PD-L1治疗。转化生长因子-β作为抗肿瘤免疫的负性调节因子，降低抗PD-1/PD-L1的疗效并诱导耐药性。开发一种新的治疗策略，同时阻断PD-1/PD-L1和TGF-β，对于增强抗PD-1/PD-L1的作用和缓解耐药性具有重要价值。

方法：基于Check-BODY™技术平台，我们开发了抗TGF-β/PD-L1双特异性抗体YM101。抗TGF-β部分的生物活性通过Smad-luciferase报告子分析、transwell分析、western blotting、CCK-8和流式细胞术测定。通过T细胞活化试验测定抗PD-L1部分的生物活性。采用EMT-6、CT26和3LL肿瘤模型研究YM101的体内抗肿瘤活性。采用RNA-seq、免疫组织化学染色和流式细胞术分析YM101对肿瘤微环境的影响。

结果：YM101能与TGF-β和PD-L1特异性结合。体外实验表明，YM101能有效对抗TGF-β和PD-1/PD-L1通路的生物学效应，包括激活Smad信号、诱导上皮-间充质转化和免疫抑制。此外，体内实验表明YM101的抗肿瘤活性优于抗TGF-β和抗PD-L1单药。从机制上讲，YM101促进了“热肿瘤”的形成：增加了肿瘤浸润淋巴细胞和树突状细胞的数量，提高了M1/M2的比例，并增强了T细胞中细胞因子的产生。这种规范化的肿瘤免疫微环境和增强的抗肿瘤免疫反应可能有助于YM101强大的抗肿瘤作用。

结论：我们的结果表明，YM101可以同时阻断TGF-β和PD-L1通路，并且与单一疗法相比具有更好的抗肿瘤效果。

关键词：双特异性抗体；肿瘤免疫治疗；免疫检查点；免疫正常化；PD-1；PD-L1；转化生长因子-β；肿瘤微环境。

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JZ、YY和PZ是武汉YZY生物医药有限公司的员工。

数字

图1
图1
YM101的基本特点。一YM101的结构。YM101包含两个抗PD-L1区域和两个抗TGF-β区域。YM101的Fc区是一个IgG1/IgG2杂交片段：CH2来自IgG2，CH3来自IgG1。b条非还原性和还原性SDS-PAGE分析的结果。在非还原YM101的车道上观察到一条单一的谱带，在还原YM10的车道上发现两条谱带。c（c）非还原和还原CE-SDS分析的结果。在未还原的CE-SDS中，检测到一个峰。在还原CE-SDS中，检测到两个峰值（一个用于短链，另一个用于长链）。YM101的纯度在99%以上。d日YM101与PD-L1的结合。用平板涂层PD-L1培养连续稀释的YM101或对照。用抗hIgG ELISA测定结合亲和力。e（电子）–克YM101与TGF-β的结合。将连续稀释的YM101或对照品与平板涂层的TGF-β1、TGF-α2和TGF-γ3孵育。用抗hIgG ELISA测定结合亲和力。小时–j同时结合TGF-β和PD-L1。将连续稀释的YM101或对照品与平板涂层的TGF-β1、TGF-α2和TGF-γ3孵育。然后，使用PD-L1-生物素和过氧化物酶偶联链霉亲和素进行ELISA检测。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图2
图2
YM101对肿瘤细胞TGF-β信号通路和上皮-间质转化的拮抗作用。一,b条Smad荧光素酶报告分析，以测量YM101对典型TGF-β信号传导的影响。在存在TGF-β1（10 ng/ml）的情况下，将Smad-luc转染的NF639和4T1细胞与YM101或对照细胞孵育24小时。然后，检测发光。c（c）,d日Transwell迁移和侵袭试验，以确定YM101对TGF-β调节癌细胞运动的影响。e（电子）Western印迹法测定YM101对癌细胞中TGF-β介导的上皮-间充质转化的影响。用TGF-β1（10 ng/ml）加抗体治疗4天后，检测到上皮-间充质转化相关标记物*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图3
图3
YM101可对抗TGF-β1诱导的Tregs分化、增殖抑制和T细胞凋亡。一YM101抑制TGF-β1诱导的Tregs分化。用平板涂层CD3、CD28、IL-2、TGF-β1和YM101或对照组处理小鼠脾细胞。流式细胞术结果显示CD4中Treg的比例+T细胞。b条,c（c）YM101逆转TGF-β1引起的T细胞增殖抑制。d日YM101抵消了TGF-β1引起的CTLL-2细胞周期分布的改变。e（电子）YM101减轻了TGF-β1介导的CTLL-2细胞凋亡。（f）YM101逆转了TGF-β1引起的HT-2细胞周期分布的改变。克YM101抑制了TGF-β1介导的HT-2细胞凋亡*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图4
图4
YM101拮抗TGF-β1引起的细胞因子释放变化。一热图显示TGF-β1和YM101对T细胞激活期间细胞因子释放的影响。b条–jYM101逆转TGF-β1介导的细胞因子释放变化，包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、IL-22、TNF-α和IL-17A*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图5
图5
YM101抵消PD-1/PD-L1介导的免疫抑制。一YM101逆转PD-1/PD-L1轴抑制IL-2生成。在存在外源性PD-L1和YM101或对照的情况下进行T细胞活化试验。b条CFSE稀释试验表明，YM101拮抗PD-1/PD-L1轴介导的T细胞增殖抑制*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图6
图6
YM101治疗抑制小鼠肿瘤模型的肿瘤生长。一探讨YM101在EMT-6模型中的最佳剂量。不同剂量YM101对小鼠EMT-6肿瘤生长曲线的影响。b条不同剂量YM101对EMT-6荷瘤小鼠体重变化曲线的影响。c（c）接受YM101治疗的EMT-6荷瘤小鼠或对照组的肿瘤图像。d日接受YM101治疗的EMT-6荷瘤小鼠或对照组的肿瘤生长曲线。e（电子）接受YM101治疗的EMT-6荷瘤小鼠或对照组的肿瘤重量。（f）接受YM101治疗的CT26荷瘤小鼠或对照组的肿瘤图像。克接受YM101治疗的CT26荷瘤小鼠或对照组的肿瘤生长曲线。小时接受YM101治疗的CT26荷瘤小鼠或对照小鼠的肿瘤重量。我接受YM101或对照治疗的携带3LL的小鼠的肿瘤图像。j接受YM101治疗的3LL荷瘤小鼠或对照组的肿瘤生长曲线。k个接受YM101治疗的3LL荷瘤小鼠或对照小鼠的肿瘤重量。我对于再激发试验，YM101治愈或治疗无效小鼠接种1 × 106最后注射YM101后第10天出现3LL细胞。米3LL再激发试验的肿瘤图像。n个3LL再激发试验的肿瘤生长曲线。o个3LL再激发试验的肿瘤重量*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-转化生长因子-β：抗转化生长因子-β，α-PD-L1：抗PD-L1，CR：完全回归
图7
图7
免疫组织化学染色法检测EMT-6肿瘤中T细胞的浸润。一–d日肿瘤浸润CD3的表现性图像+肿瘤周边和肿瘤中心的细胞。标尺，250μm或50μm。e（电子）肿瘤浸润CD3数量的定量分析+细胞和CD3的比例+使用了面积。（f）入渗深度的定量分析。CD3的渗透深度+细胞通过所有CD3的平均最近距离计算+肿瘤边缘的细胞。平均最近距离按相应肿瘤边界到肿瘤中心的距离缩放。克,小时肿瘤浸润性CD4的代表性图像+和CD8+肿瘤周边和肿瘤中心的细胞。比例尺，100μm*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图8
图8
流式细胞术分析EMT-6肿瘤的肿瘤免疫微环境。的代表性图像一肿瘤浸润淋巴细胞，b条T细胞，c（c）颗粒酶B+T细胞，d日CD107a型+T细胞，e（电子）CD8（CD8）+T细胞，（f）树突状细胞（DC），克巨噬细胞。通过制备的细胞悬浮液中肿瘤浸润免疫细胞与总活细胞的比率进行相对定量分析*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-转化生长因子-β：抗转化生长因子-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图9
图9
RNA-seq探索EMT-6肿瘤的免疫景观。一所有差异表达基因表达水平的热图（折叠变化 > 2,第页 < 0.05).b条的表达式级别[The Reads Per Kilobase Per Million mapped Reads（RPKM）]价格1,Ifng公司,Gzma公司、和Gzmb公司.c（c）–小时T细胞特征、NK特征、树突状细胞（DC）特征、巨噬细胞特征、IFN-α反应特征、IFN-γ反应特征中基因的表达水平*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图10
图10
免疫组织化学染色评估癌相关成纤维细胞的活性、癌细胞介导的上皮-间充质转化状态以及癌细胞的增殖和凋亡。一H&E染色。b条抗α-SMA染色。c（c）苦味酸红染色。d日抗E粘附素染色。e（电子）抗病毒素染色。（f）抗Ki-67染色。克抗-PCNA染色。小时抗叶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。为了进行定量分析，计算了IHC染色值的积分光密度（IOD）*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001表示与YM101治疗相比的显著差异。比例尺，100μm。α-TGF-β：抗TGF-β，α-PD-L1：抗PD-L1
图11
图11
YM101对肿瘤免疫循环和肿瘤细胞的影响示意图。首先，YM101通过抑制癌相关成纤维细胞（CAF）的活性促进T细胞浸润。其次，YM101通过阻断PD-1/PD-L1和归化TGF-β增强T细胞的肿瘤杀伤活性。第三，YM101改变了巨噬细胞的极化，增加了M1/M2的比率。此外，YM101增加了树突状细胞（DC）的密度，这有利于TME中抗原的提呈。最后，YM101对抗肿瘤细胞中的上皮-间充质转化（EMT）
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