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.2021年2月5日13:1099-1111。
doi:10.2147/CMAR。S278023。 eCollection 2021年。

雷公藤红素通过circ_SLIT3/miR-223-3p/CXCR4轴对肝癌的抗肿瘤作用

海龙寺 1, 王慧玲 1, 肖海娟 2, 于芳 1, 吴兆丽 2
附属公司

Celastrol通过circ_SLIT3/miR-223-3p/CXCR4轴对肝癌的抗肿瘤作用

海龙寺等。 癌症管理研究. .

摘要

背景：Celastrol是一种潜在的抗肝癌药物。确定雷公藤红素抗肝癌作用的分子决定因素仍然具有挑战性。在这项研究中，我们着手将环状RNA（circRNAs）与雷公藤红素的抗肝癌分子决定簇联系起来。

方法：分别采用集落形成、3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基-2H-四唑溴化铵（MTS）、transwell和流式细胞术检测细胞集落形成，增殖，迁移，侵袭和凋亡。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹检测circRNA狭缝引导配体3（circ_SLIT3）、miR-223-3p和C-X-C基序趋化因子受体4（CXCR4）的水平。进行核糖核酸酶R（RNase R）和放线菌素D测定以评估circ_SLIT3的稳定性。circ_SLIT3、miR-223-3p和CXCR4之间的靶向关系通过双核糖核酸酶报告分析得到证实。通过体内实验检测雷公藤红素和circ_SLIT3对体内肿瘤生长的作用。

结果：Celastrol在体外抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭，并增强凋亡，在体内抑制肿瘤生长。雷公藤红素下调肝癌细胞中circ_SLIT3的表达，雷公藤红素通过下调circ_SLIT3在体外和体内对肝癌发挥抗肿瘤作用。从机制上讲，circ_SLIT3直接与miR-223-3p相互作用，circ_SLIT3通过吸收miR-223-3p来控制CXCR4的表达。此外，miR-223-3p参与了雷公藤红素/circ_SLIT3介导的肝癌进展调控。此外，雷公藤红素通过miR-223-3p/CXCR4轴在体外发挥抗肝癌作用。

结论：我们目前的工作首次确定circ_SLIT3/miR-223-3p/CXCR4轴是雷公藤红素抗肝癌作用的新机制，为circRNAs参与雷公藤黄素抗肿瘤分子决定簇提供了新的见解。

关键词：CXCR4；雷公藤红素；circ_SLIT3；肝细胞癌；miR-223-3p。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们对这项工作没有利益冲突。

数字

图1
图1
Celastrol在体外对肝癌有潜在的抗肿瘤作用。用模拟、0.5或1µM雷公藤红素（Cela）处理Huh7和Hep3B细胞48小时(A类)集落形成试验，用于测定处理细胞的集落形成能力。(B类和C类)MTS细胞增殖试验。(D类和E类)细胞迁移和侵袭的Transwell分析。(F类)流式细胞术检测细胞凋亡。n=3；数据表示为平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或****P（P）<0.0001 vs对照。
图2
图2
Celastrol下调肝癌细胞中circ_SLIT3的表达。(A类)通过H&E染色确认HCC组织和匹配的正常组织。与正常组织相比，箭头表示肿瘤组织排列紊乱。qRT-PCR检测50对肝癌组织和匹配正常组织中circ_SLIT3的相对表达(B类)、THLE-2、Huh7、Hep3B细胞和1µM雷公藤红素（Cela）处理的肝癌细胞(C类). 用qRT-PCR检测RNase R孵育的总RNA中circ_SLIT3和SLIT3线性转录物的水平(D类和E类)放线菌素D孵育的Huh7和Hep3B细胞(F类和G公司). n＝3；数据表示为平均值±SD**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或****P（P）<0.0001 vs Normal、THLE-2细胞、Huh7细胞、Hep3B细胞、Mock或circ_SLIT3。
图3
图3
雷公藤红素通过下调circ_SLIT3在体外对HCC产生抗肿瘤作用。(A类和B类)通过qRT-PCR检测转染Vector或circ_SLIT3的雷公藤红素（Cela）处理的Huh7和Hep3B细胞中circ_SLIT3和SLIT3线性转录物的水平。用Vector或circ_SLIT3转染Huh7和Hep3B细胞24小时，然后用1µM雷公藤红素（Cela）处理48小时，然后使用集落形成分析检测细胞集落形成(C类)，MTS分析的细胞增殖(D类和E类)Western blot检测Ki67水平(F类)transwell分析法检测细胞迁移和侵袭(G公司和H（H）)流式细胞术检测细胞凋亡(我)Western blot检测Bcl-2和Bax水平(J型和K（K）). 载体：阴性对照质粒，circ_SLIT3：circ_SLINT3过度表达质粒。n=3；数据表示为平均值±SD**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或****P（P）<0.0001 vs矢量、控制或Cela+矢量。
图4
图4
Circ_SLIT3通过结合miR-223-3p与miR-223-4p相互作用。(A类)推测的miR-223-3p与circ_SLIT3结合序列的示意图，该序列由CircInteractome工具鉴定，种子区域发生突变。(B类和C类)Huh7和Hep3B细胞中的双荧光素酶分析。qRT-PCR检测转染载体或circ_SLIT3的雷公藤红素（Cela）处理的Huh7和Hep3B细胞中miR-223-3p的表达(D类)、THLE-2、Huh7、Hep3B细胞和1µM雷公藤红素（Cela）处理的肝癌细胞(E类)，50对HCC组织和匹配的正常组织(F类). 载体：阴性对照质粒，circ_SLIT3：circ_SLINT3过度表达质粒。(G公司)使用Spearman试验研究肝癌组织中miR-223-3p表达与circ_SLIT3水平的相关性。n=3；数据表示为平均值±SD**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或****P（P）<0.0001 vs miR-NC模拟、载体、THLE-2细胞、Huh7细胞、Hep3B细胞或正常。
图5
图5
雷公藤红素/circ_SLIT3轴通过miR-223-3p在体外调节HCC进展。(A类)通过qRT-PCR在转染Vector、circ_SLIT3、circ_SLIT3+miR-NC模拟物或circ_SLIT3+miR_223-3p模拟物的celastrol（Cela）处理的Huh7和Hep3B细胞中表达miR-223-3p。将Huh7和Hep3B细胞转染Vector、circ_SLIT3、circ_SLIT3+miR-NC模拟物或circ_SLIT3+miR223-3p模拟物24 h，然后用1µM的塞拉司他醇（Cela）处理48 h，然后通过集落形成分析测定细胞集落形成(B类)，MTS检测的细胞增殖(C类和D类)Western blot检测Ki67水平(E类)transwell分析法检测细胞迁移和侵袭(F类和G公司)流式细胞术检测细胞凋亡(H（H）)Western blot检测Bcl-2和Bax水平(我和J型). 载体：阴性对照质粒，circ_SLIT3：circ_SLIT3过表达质粒。n＝3；数据表示为平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01或***P（P）<0.001 vs Vector、circ_SLIT3+miR-NC、Control、Cela+Vector或Cela+circ_SLIT3+miR-NC。
图6
图6
Circ_SLIT3作为miR-223-3p海绵来控制CXCR4的表达。(A类)CXCR4 3ʹUTR内的miR-223-3p假定靶点示意图和种子区突变。(B类和C类)Huh7和Hep3B细胞中的双荧光素酶实验。miR-223-3p(D类)和CXCR4 mRNA(E类)qRT-PCR检测水平和Western blot检测CXCR4蛋白表达(F类)在雷公藤红素（Cela）处理的Huh7和Hep3B细胞中，转染miR-NC模拟物、miR-223-3p模拟物、抗miR-NC或抗miR-223-23p。(G公司和H（H）)THLE-2、Huh7、Hep3B细胞和雷公藤红素（Cela）处理的肝癌细胞中CXCR4 mRNA和蛋白水平。(我)50对肝癌组织和匹配正常组织中CXCR4 mRNA的表达。(J型和K（K）)使用Spearman试验研究肝癌组织中circ_SLIT3、miR-223-3p和CXCR4 mRNA水平之间的相关性。(L（左）)CXCR4蛋白在肝癌组织和匹配正常组织中的表达。(M（M）和N个)转染Vector、circ_SLIT3、circ_SLIT3+miR-NC模拟物或circ_SLIT3+miR_223-3p的雷公藤红素（Cela）处理的Huh7和Hep3B细胞中CXCR4 mRNA和蛋白水平。载体：阴性对照质粒，circ_SLIT3：circ_SLINT3过度表达质粒。n=3；数据表示为平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或****P（P）<0.0001 vs miR-NC模拟物、抗miR-NC、THLE-2细胞、Huh7细胞、Hep3B细胞、Normal、Vector或circ_SLIT3+miR-NC模仿物。
图7
图7
miR-223-3p缺失通过上调CXCR4在体外逆转雷公藤红素对肝癌的抗肿瘤作用。(A类和B类)转染抗miR-NC、抗miR-223-3p、抗miR-223-3p+si-NC或抗miR-233-3p+si-CXCR4的celastrol（Cela）处理的Huh7和Hep3B细胞中CXCR4 mRNA和蛋白水平。将抗miR-NC、抗miR-223-3p、抗miR223-3p+si-NC或抗miR-233-3p+si-CXCR4转染Huh7和Hep3B细胞24 h，然后用1µM雷公藤红素（Cela）处理48 h，然后通过集落形成分析测量细胞集落形成(C类)，MTS分析的细胞增殖(D类和E类)Western blot检测Ki67水平(F类)transwell分析法检测细胞迁移和侵袭(G公司和H（H）)流式细胞术检测细胞凋亡(我)Western blot检测Bcl-2和Bax水平(J型和K（K）). n＝3；数据表示为平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01或***P（P）<0.001与抗miR-NC、抗miR-223-3p+si-NC、对照、Cela+anti-miR-NC或Cela+anti-miR-223-4p+si-CXCR4相比。
图8
图8
雷公藤红素通过circ_SLIT3对体内肿瘤生长产生抗肿瘤作用。将未转导、慢-NC感染或慢circ_SLIT3转导的Hep3B细胞植入裸鼠皮下（每组6个）。植入5天后，每隔5天腹腔注射雷公藤红素（2mg/kg）。(A类)异种移植瘤的生长曲线。(B类)切除肿瘤的平均重量。circ_SLIT3的级别(C类)，miR-223-3p(D类)和CXCR4 mRNA(E类)qRT-PCR和CXCR4蛋白表达(F类)在异种移植瘤中。(G公司)免疫组化法检测CXCR4、Ki67、Bcl-2和Bax在异种移植瘤中的表达。n=6；数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05或**P（P）与对照组或Cela+lent-NC相比<0.01。
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赠款和资金

本研究得到了国家自然科学基金（No.81704066）、陕西中医药大学学科创新团队（2019-YL06）的资助。