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.2021年2月2日;34(5):108689.
doi:10.1016/j.celrep.2021.108689。

NIX通过DRP1启动线粒体断裂以驱动表皮分化

附属公司

NIX通过DRP1启动线粒体断裂以驱动表皮分化

科里·L·辛普森等。 单元格代表. .

摘要

表皮不断再生,以在身体表面维持一个由分化的角质形成细胞组成的保护屏障。这种分层组织的成熟需要角质形成细胞在到达最外层组织时经历大规模的细胞器降解,形成致密的无核细胞。通过对人类表皮器官型培养物的实时成像,我们发现线粒体的调节性分解对表皮发育至关重要。上层角质形成细胞在上调线粒体系留自噬受体NIX后,启动线粒体断裂、去极化和酸化。耗尽NIX会破坏表皮成熟并损害线粒体清除,而异位NIX表达会加速角质形成细胞分化,并通过鸟苷三磷酸酶(GTPase)DRP1导致线粒体过早断裂。我们进一步证明,抑制DRP1可以阻止NIX介导的线粒体分解并干扰表皮发育。我们的发现确立了线粒体降解是终末角质形成细胞分化的关键步骤,并定义了一条通过NIX与DRP1协同作用的有丝分裂受体来驱动表皮形态发生的途径。

关键词:自噬;角化;区别;表皮;上皮形态发生;裂变;角质形成细胞;活体显微镜;线粒体;线粒体自噬。

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利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.角质形成细胞线粒体在器官型表皮的上层发生断裂、去极化和酸化
(A) SDC显微镜显示,带有标记线粒体(绿色细胞)的NHEK随着分层(箭头)形成器官型表皮而逐渐分化。(B) 表皮培养物下层与上层Mito-dsRed的SDC图像。(C和D)细胞线粒体周长和(D)面积定量相对于其与组织顶部的z距离(平均值±SD,n=60场,4个实验(实验),***p<0.0001)。(E) 器官型表皮上下层TOM20-mCh标记线粒体的SDC图像。(F) GFP标记的线粒体和TMRE染料在含有或不含破碎线粒体的细胞的过渡层中的SDC图像。(G)量化破碎线粒体与非破碎线粒体细胞对的相对TMRE强度(平均±SD,n=24个细胞对,4个实验,***p<0.0001)。(H) 串联荧光团GFP-mCh通过Cox8靶向序列导入线粒体。在中性pH下,这两种荧光团都是活性的,而酸性pH在进入溶酶体(LYSO)时会淬灭GFP。(一) 上下层器官型表皮表达Cox8-GFP-mCh的SDC图像。(J) 器官型表皮上层的TEM图像,第二层膜(箭头)内有球形线粒体碎片,表明有丝分裂。白色刻度条,10μm;黑色标尺,500 nm。
图2。
图2调节线粒体去极化和溶酶体酸化对正确的表皮分化至关重要
(A) 9天后,DMSO和BafA1处理的表皮培养物进行H&E染色,突出显示KH颗粒(白色箭头)和角化层中保留的细胞核(黄色箭头)。(B) 二甲基亚砜和BafA1处理的培养物裂解液中LC3的WB和表皮分化的早期(Dsg1,K10)和晚期(Loricrin)标记。(C) BafA1破坏溶酶体酸化,EACC抑制自噬体-LYSO融合,CCCP使线粒体去极化。(D)DMSO或EACC处理的培养物的H&E染色,突出显示KH颗粒(白色箭头)和保留核(黄色箭头)。(E) 二甲基亚砜和EACC处理培养物中每高倍视野(hpf)保留核(平均±SD,n=17视野,**p=0.0002)和FLG IF(平均±标准偏差,n=20视野,***p<0.0001)的定量。(F) 在DMSO和EACC处理的培养物中的FLG的IF。(G) 用二甲基亚砜或CCCP处理的培养物的H&E染色显示KH颗粒(白色箭头)和保留的细胞核(黄色箭头)。(H) 二甲基亚砜与CCCP处理培养物中保留细胞核(平均±SD,n=57个域,***p<0.0001)和FLG IF(平均±标准偏差,n=8个域,*p=0.0286)的定量。(I) 在DMSO和CCCP处理的培养物中的FLG的IF。虚线表示表皮的底部。白色刻度条,10μm;黑色刻度条,50μm。
图3。
图3线粒体定位的自噬受体NIX在上表皮层上调
(A) 表皮图,显示随着角质形成细胞分化,上层NIX表达增加。(B) NIX在正常人皮肤和器官型培养物中的IF。(C) 器官型表皮内源性NIX和TOM20的IF。(D) 生长6或9天的未分化NHEK与表皮培养物裂解液中NIX的WB(低于TOM20标准化的相对带强度)。(E) NIX(HIF-1a的转录靶点)的调控图。DMOG抑制脯氨酰羟化酶(PHs)或DFP螯合铁可减轻HIF-1a的抑制,从而导致NIX增加。(F) WB和用DMSO或DMOG处理的NHEK裂解物中NIX的定量(平均值±SD,n=4 exps.,*p=0.039)。(G) 用DFP治疗的未分化NHEK中NIX和TOM20的IF。(H) 二甲基亚砜、氯化钴处理的NHEK中NIX和TOM20的IF2或134欧元。(一) 二甲基亚砜、氯化钴处理的NHEK中NIX IF(相对于TOM20)的定量2或EUK134(平均值±标准偏差,n=33个字段,p<0.0001)。(J) 用GFP-NIX转导的未分化NHEK的受激发射完成(STED)显微镜图像,并对TOM20进行免疫染色。虚线表示表皮的底部。白色刻度条,10μm。
图4。
图4 NIX缺失导致角质形成细胞有丝分裂受损和表皮分化缺陷
对照组和NIX缺失的THEK(NIX KO-1和KO-2)的器官型培养物(A和B)H&E染色,上层出现肿胀、空泡化和角化不良细胞(黄色箭头)。(C) 对照与KO培养中角化不良细胞的定量(平均值±SD,n=53场,3次实验,***p<0.0001)。(D) 对照和KO培养物裂解液中NIX的WB。(E) K10和Dsg1的IF,显示NIX KO培养物中角蛋白表达和细胞形态发生改变;星号表示基底上细胞缺乏细胞质K10染色。(F) 对照组与KO培养组K10-阴性细胞的定量(平均值±SD,n=20域,***p<0.0001)。(G) 对照组与KO组基底上细胞平均圆度的量化(直线,平均值;方框,25第个–75第个百分位数;胡须,5第个–95第个百分位数;n=来自20个字段的376个单元格,**p=0.0003)。(H) 对照培养物的TEM图像,显示线粒体自噬事件(绿色箭头)和最上层膜细胞器的清除;NIX缺失的表皮显示线粒体(黄色箭头)滞留。(一) 对照组与KO培养组上层相对电子密度的量化(平均值±SD,n=63个场,2条KO线,**p=0.0015)。虚线表示表皮的底部。白色刻度条,10μm;H&E黑色刻度条,50μm;TEM黑色标尺,100 nm。
图5。
图5 NIX过早表达导致线粒体断裂并加速表皮分化
(A) 生长3、6或9天的表皮培养物裂解液中NIX的WB和分化标记物(Dsg1和K10),以及NIX相对表达的(底部)量化(平均值±SD;n=3个实验值,**p=0.0071)。(B) 体外表达GFP和GFP-NIX的培养物的H&E染色以及组织厚度(平均值±SD,n=201个字段,6个实验,***p<0.0001)和角化不良细胞(平均值?SD,n=150个字段,六个实验,****p<0.0002)的(底部)量化。(C) 对照培养物下层的TEM图像显示管状线粒体(绿色箭头),表达GFP-NIX的培养物下层的TEM图像显示线粒体收缩(蓝色箭头)、部分吞噬的线粒体(品红色箭头)和线粒体自噬事件(黄色箭头)。(D) DMSO处理的培养物的H&E染色与NIX和TOM20的EUK134和(底部)IF进行比较。(E) DMSO和EUK134处理培养物中组织厚度的量化(平均值±SD,n=22个字段,***p<0.0001)。(F) 用二甲基亚砜处理的培养物的裂解物WB与EUK134的比较,以及相对NIX蛋白水平的(底部)量化(平均值±SD,n=5个实验,**p=0.0006)。(G) 用微管蛋白-mCh和GFP-Mito与GFP-NIX转导的未分化NHEK的SDC图像,以及(右)量化GFP-Mito-与GFP-NIX阳性线粒体的线粒体长度、周长和AR(平均值±SD,n=78个细胞,3个实验,***p<0.0001)。(H) 显示GFP标记的NIX构造的图。(一) 用GFP标记的NIX构建物转导NHEK的SDC图像并用TMRE孵育。(J) 定量表达NIX结构的NHEK中的线粒体长度(平均值±SD;n=163个细胞,4个实验,***p<0.0001)。虚线表示表皮的底部。白色刻度条,10μm;H&E黑色刻度条,50μm;TEM黑色标尺,400 nm。
图6。
图6 NIX通过裂变GTPase DRP1驱动线粒体碎片
(A) 用GFP-NIX(B)转导的NHEK中DRP1 IF的SDC图像显示了外周偏倚的测量值,即从细胞核到每个粒子的距离(标记A)与从细胞核到细胞边缘的距离(标识B)之间的比率。(C) 量化表达GFP-NIX的细胞中DRP1颗粒与相邻非转导细胞的外周偏倚(平均值±SD,n=19个细胞对,4个实验,*p=0.0148)。(D) GFP-NIX转导的NHEK中FIS1 IF的SDC图像。(E) 描述GFP-NIX阳性线粒体(绿色边缘)的模型,其表面稳定有FIS1,其招募DRP1,导致线粒体断裂。(F) Halo-FIS1转导的NHEK中DRP1和Hsp60 IF的SDC图像。(G) 表达Halo-FIS1的NHEK与非转导邻居相比线粒体AR和周长的定量(平均值±SD,n=14个细胞对,3个实验,***p<0.0001)。(H) 人皮肤中FIS1和NIX的IF。(一) 单独使用GFP-NIX转导的NHEK的SDC图像(顶部面板)与与DRP1-K38A联合转导的相邻细胞(底部面板)的SDC图。(J) 单独或与DRP1-K38A一起表达GFP-NIX的NHEK中线粒体AR和周长的定量(平均值±SD,n=54个细胞,4个实验,***p<0.0001)。白色刻度条,10μm。
图7。
图7通过DRP1阻断线粒体分裂损害表皮分化
(A) 成熟表皮培养物中DRP1和TOM20的IF。(B) 用DMSO或Mdivi-1处理的器官型表皮的H&E染色显示角化层中的保留核(黄色箭头),以及DMSO与Mdivi-1-处理的培养物中保留核的(右)量化(平均值±SD,n=70个区域,4个实验,***p<0.0001)。(C) 用Mdivi-1处理或用DRP1-K38A转导的有机型培养物裂解产物中DRP1的WB。(D) 用TOM20-mCh、DRP1-K38A或病毒载体转导的上层细胞线粒体大小的量化(平均值±SD,n=61个字段,4个实验,***p<0.0001)。(E) 器官型表皮上层的SDC图像仅表达TOM20-mCh(左)或与DRP1-K38A(右)。(F) 对表达病毒载体或DRP1-K38A的培养物进行H&E染色,突出KH颗粒(白色箭头)和保留核(黄色箭头),并(底部)量化组织厚度(平均值±SD,n=103个字段,4个实验,***p<0.0001)和保留细胞核(平均值?SD,n=101个字段,四个实验,*p=0.0115)在表达载体与DRP1-K38A的培养基中。(G) 表达载体或DRP1-K38A的器官型培养物中K10和FLG的IF,K10-阳性细胞大小的定量(平均值±SD,n=30个域,***p<0.0001)和FLG染色(平均值SD,n=30个域,****p<0.0000)。虚线表示表皮的底部。黑色标尺,50μm;白色刻度条,10μm。(H) 描述由低氧调节信号驱动的分化角质形成细胞层NIX表达开始的模型;NIX阳性线粒体(绿色边缘)显示FIS1的定位增强,FIS1招募DRP1产生线粒体片段,靶向最上层的表皮层溶酶体降解。

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引用人

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