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.2021年2月1日;17(2):e1009256。
doi:10.1371/journal.ppat.1009256。 电子采集2021年2月。

莱姆病小鼠模型显示伯氏疏螺旋体定植于硬脑膜并诱导中枢神经系统炎症

附属公司

莱姆病小鼠模型显示伯氏疏螺旋体定植于硬脑膜并诱导中枢神经系统炎症

蒂莫西·卡塞利等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

莱姆病是由伯氏疏螺旋体及其相关物种感染引起的,可导致炎症病理,影响关节、心脏和神经系统,包括中枢神经系统(CNS)。近交实验小鼠已被用于确定伯氏狸殖吸虫感染的动力学以及关节和心脏的宿主免疫反应,但在这些动物的中枢神经系统中缺乏类似的研究。研究中枢神经系统中宿主-鲍氏体相互作用的温顺动物模型是理解中枢神经系统发病机制的关键。因此,我们对早期和亚急性感染期间小鼠中枢神经系统中伯氏双歧杆菌定殖和相关免疫反应的动力学进行了表征。通过荧光免疫组织化学、活体显微镜、细菌培养和定量PCR,我们发现布氏杆菌经常在C3H小鼠的硬脑膜定植,感染后第7天螺旋体负荷达到峰值。观察到几种莱姆病病原体(包括勃艮第芽孢杆菌、加里尼芽孢杆菌和马约尼芽孢杆菌)的杜拉马定殖。RNA测序和定量RT-PCR显示,伯氏囊原虫感染与炎性细胞因子表达增加和硬脑膜中干扰素(IFN)反应增强有关。在感染动物的脑膜中也观察到组织病理学变化,包括白细胞浸润和血管变化。与脑膜相反,我们在感染期间未检测到伯氏杆菌、浸润白细胞或大脑皮层或海马细胞因子谱的大规模变化;然而,在外周组织和脑膜中观察到的两个脑区IFN刺激基因的表达发生了类似的变化。总之,布氏杆菌能够在实验室小鼠的脑膜上定植,并诱导类似于周围组织的局部炎症。在没有伯格多氏杆菌或炎性细胞因子的情况下,干扰素的无菌反应是脑实质特有的,并为深入了解与这种重要病原体相关的中枢神经系统病理学的潜在机制提供了线索。

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数字

图1
图1。与本研究相关的中枢神经系统解剖结构。
答:。冠状面示意图显示颅骨相关脑膜的结构。如图所示,三层脑膜包括硬脑膜(黄色)、蛛网膜(粉红色)和软脑膜(紫色)将脑实质与颅盖骨分开。蛛网膜下是蛛网网膜下腔,脑脊液(CSF)通过它流动。脑膜由血管高度灌注(动脉显示为红色,静脉显示为蓝色),流向硬脑膜的血液由静脉窦排出,如图所示,包括上矢状窦。B。左图:开颅手术后从颅骨中取出的硬脑膜,用于螺旋体计数、RNA提取和流式细胞术。硬脑膜静脉窦被标记。右侧面板:使用网格盖玻片(0.36mm)人工计数螺旋体所用网格模式的示意图2网格方块)。使用系统随机抽样,随机选择一个起始平方,然后每十平方计数一次,对1000多个阳性事件的样本进行计数。使用红色网格方块显示计数方案示例。所有计数均归一化为总面积96.48mm2(268个方块)。C、。冠状面示意图,显示用于提取RNA的脑实质结构(大脑皮层、海马体)。还显示了第三个心室的位置。脉络丛位于脑室内(未显示)。一个C类是使用修改后的图像创建的BioRender.com网站.
图2
图2。伯格多费里在早期感染期间,广泛感染硬脑膜。
B类.答。代表性共焦z系列显示B类.伯格多费里(Bb,绿色)、血管(CD31,红色)和有核细胞(TOPRO3,蓝色)在感染106螺旋体。还显示了图像的X轴旋转(XZ)和Y轴旋转(ZY)。B。硬脑膜中完整螺旋体的数量(log10感染后不同时间点的平均值±标准差)6螺旋体。符号α和β表示统计上不同的组(p≤0.003;α=0.05),这是通过单因素方差分析(ANOVA)和全配对多重比较(Holm-Sidak)确定的。C、。硬脑膜中的螺旋体数量(log10平均值±标准差)。符号α和β表示统计上不同的组(0.021<p<0.048;α=0.05),这是通过单因素方差分析和全配对多重比较(Holm-Sidak)确定的。D。 B类.伯格多费里硬脑膜负荷(对数10根据接种部位(脚、腰、胸)和感染10只皮下感染小鼠的感染持续时间(第7天、第28天)得出的平均值±标准差6螺旋体。星号表示使用Student t检验确定的显著差异(p=0.009;α=0.05)。“n.s”表示单向方差分析无统计学意义(p=0.4;α=0.05)。E.公司。接种10后感染第7天硬脑膜中的细菌负荷6 B类.伯格多费里应变B31或应变297。“n.s”表示经Student t检验无统计学意义(p=0.07;α=0.05)。(B-E),如材料和方法以及图1B所述,使用f-IHC、落射荧光显微镜和网格盖玻片通过系统计数对硬脑膜中的螺旋体进行计数。所示计数标准化为开颅术后颅骨相关硬脑膜的近似面积(96.5毫米2). 酒吧上方每组列出了可检测到螺旋体的硬脑膜样本数量/总n。统计分析中省略了少于两个阳性硬脑膜样本的情况。F、。感染7–28天的小鼠在BSK培养基中产生阳性培养物的分离硬脑膜样本数量B类.伯格多费里隔离297,B类.加里尼语,或B类.马约尼语用暗场显微镜测定。
图3
图3。B类.伯格多费里硬脑膜是血管外活动的。
用GFP-Bb_297感染7天后来自C3H小鼠的离体硬脑膜的多光子图像。B类.伯格多费里以绿色显示;胶原蛋白(二次谐波)以蓝色显示。成像参数:波长=910 nm,像素分辨率=135。有关显示螺旋体运动的图像系列电影,请参见S1电影。
图4
图4。感染B类.伯格多费里导致硬脑膜中的白细胞浸润。
答:。用苏木精和伊红染色带有硬脑膜的颅盖骨冠状切片,并对60个有代表性的切片进行系统的炎症评估。堆叠条形图显示了每只老鼠的切片数量以及组织学表现,如图例所示。显示了每只小鼠的感染时间点。与出血相关的血管周围白细胞浸润的代表性z系列图像(B类)血管周围浸润延伸至轻微脑膜炎(C类)如图所示,放大100倍和400倍。100X图像中的方框区域显示用于高放大的区域。有关全分辨率图像,请参见S9–S12图。D。条形图显示感染后第7天与未感染对照组相比,硬脑膜中免疫细胞亚型±s.d.的频率,用流式细胞术测定(每组6例)。条形图表示根据正向和侧向散射面积对感兴趣的细胞进行选通后的活事件百分比(所有硬脑膜样本的活事件平均数±s.d.=5524±2643)。S1图中概述了细胞亚型的详细门控策略。细胞群定义为:T细胞:CD45+CD3+;B细胞:CD45+CD19+;富含单核细胞/巨噬细胞:CD45+CD3-CD19-CD11b+Ly6G-;富含颗粒细胞:CD45+CD3-CD19-CD11b+Ly6G+。星号表示使用Student t检验确定的具有统计差异的组(0.003≤p≤0.010;α=0.05)。E.公司。未感染和7天感染小鼠的共焦图像具有代表性。显示T细胞(CD3,绿色)、血管(CD31,红色)和有核细胞(TOPRO3,蓝色)。
图5
图5。感染B类.伯格多费里与血管周围出血混合在软脑膜和脑室中的白细胞,没有白细胞渗入脑实质有关。
未受感染的小鼠在检查的脑切片中未发现炎症的显微镜证据(A-C)而在脑膜中观察到血管周围出血伴白细胞(D),心室延伸至室管膜下区(E)以及整个脉络丛(F)感染后第7天。在对照组或感染组小鼠的大脑皮层、海马或丘脑中均未发现白细胞浸润。感染状态显示在面板的左侧,放大倍数显示在右侧。100X图像中的方框区域显示用于高放大的区域。全分辨率图像参见S13–S21图。
图6
图6。感染B类.伯格多费里导致脑膜和脑实质的转录组变化。
答:。Venn图显示了与未感染的对照组(每个时间点n=4)相比,7天感染小鼠的硬脑膜、大脑皮层和海马(padj≤0.05,basemean≥20,倍数变化≥1.5)中不同和常见的显著上调和下调基因的数量。B。测试的三种组织的火山图比较-log(padj)与log2(fold-change)用于所有基因。红色表示DEG,而灰色表示感染小鼠和对照小鼠之间的基因没有显著差异。单个样本的主成分分析和层次聚类见图S2。
图7
图7。硬脑膜、皮质和海马中上调的基因与干扰素反应相一致,而炎性细胞因子的上调仅限于硬脑膜。
答:。Cnet图(使用ClusterProfiler[101]生成)显示与感染C3H小鼠硬脑膜RNA-seq数据集中上调的前5个GO项相关的单个基因。彩色节点表示GO术语,节点描述表示为方框文本。节点大小与相关基因的数量相关,如图例所示。单个上调基因由灰点表示,线条连接到相关GO术语。B。Cnet图,如所述(A)显示前10个富含GO的术语和相关基因通常在所有三个组织中上调。C、。日志的条形图表示2(倍数变化)来自(A)条表示DEG的变化幅度,而“N”表示没有差异表达的基因,表明细胞因子反应的组织特异性。D。从中选择基因的RNA-seq数据的条形图表示(B)显示三种组织的反应相似。E.公司。每个组织中上调基因的比例以及IFN预测上调的所有组织中通常上调的基因[40]。F、。维恩图显示了预计会被I型或II型干扰素刺激的每个组织中上调的二甘醇数量[40]。
图8
图8。硬脑膜的定植与细胞外基质相关基因的下调有关。
答:。在硬脑膜中富含下调基因的选定生物过程GO术语。水平条右侧的数字显示与每个术语相关的下调DEG的数量。条形图大小表示富集程度(-log(padj))。B。与GO术语相关的RNA-seq数据集中所选基因的Log2(折叠变化)(A) ●●●●。条形代表差异表达基因的变化幅度,而“N”代表RNA-seq数据集中没有显著差异表达的基因;证明反应的组织特异性。Φ表示统计显著性(p=0.003),但不符合预定的折叠式分界值,被归类为DEG(折叠式变化=1.3;DEG分界值=1.5)。
图9
图9。炎症细胞因子的表达在晚期播散性感染期间持续增加,而干扰素反应仅限于早期感染。
如图例所示,感染后第7-56天,来自硬脑膜(dura)、皮层、海马(hippo)、胫跗关节(joint)和心脏组织的选定基因的qRT-PCR(n=4个/时间点)。这个B类.伯氏菌基因脂肪显示为基因拷贝(日志10平均值±标准差)。水平脂肪大脑皮层和海马区的拷贝数低于检测极限。宿主基因肿瘤坏死因子,gbp2标准、和干扰素诱导蛋白10显示为日志2(折叠式变化)(平均值±标准差)与使用ΔΔCt方法测定的未感染对照组相比。星号表示使用单因素方差分析和Dunnett检验得出的统计显著性(0.001≤p≤0.026;α=0.05)。
图10
图10。B细胞和T细胞是控制持续感染期间螺旋体负荷所必需的,但白细胞浸润或ISG上调则不需要。
答:。细菌负荷(对数10平均值±s.d.)(每种情况n=3)。如材料与方法和图1B所述,通过使用f-IHC、外荧光显微镜和网格盖玻片进行系统计数,对隔离硬脑膜中的螺旋体进行计数。星号表示使用Student t检验的统计显著性(p≤0.001;α=0.05)。B。感染后第7-28天SCID小鼠和未感染对照组的硬脑膜组织病理学(详见图4图例)。堆叠条形图显示了每只老鼠的切片数(共60个),组织学表现如图例所示。显示了每只小鼠的感染时间点。C、。感染后第7天(n=3),C3H和SCID小鼠的硬脑膜(dura)、皮层、海马(hippo)和胫跗关节(joint)中指示ISG的qRT-PCR。条形图显示为日志2与使用ΔΔCt法测定的每个组织的未感染对照样品相比,(折迭变化)±标准差。星号表示与未感染对照组相比具有统计学意义(0.001≤p≤0.04;α=0.05),而δ表示C3H和SCID小鼠之间的差异(0.004≤p≤0.05;α=0.0.05),使用Student t检验。

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引用人

工具书类

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