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.2021年1月30日；40(1):48.
doi:10.1186/s13046-021-01849-2。

环状RNA circZFR通过调节SSBP1/CDK2/cyclin E1复合物磷酸化Rb促进宫颈癌进展

周明义 1, 卓扬 1, 王丹波 2, 陈鹏（音） 1, 张勇（音） 三
附属公司

环状RNA circZFR通过调节SSBP1/CDK2/cyclin E1复合物磷酸化Rb促进宫颈癌进展

周明义等。 实验临床癌症研究杂志. .

摘要

背景：作为一种新型的非编码RNA，环状RNA（circRNAs）在包括癌症在内的各种疾病的发生和发展中起着至关重要的作用。然而，circRNAs在人类宫颈癌中的确切功能尚不清楚。

方法：我们鉴定了宫颈癌和配对相邻正常组织之间上调的circRNA的circRNA特征。使用两个不同的队列和GEO数据库，共鉴定出6个上调的circRNAs，其倍数变化>2，P<0.05。在这六个circRNA中，hsa_circ_0072088（circZFR）是宫颈癌中唯一显著过度表达的外显子circRNA。为了研究circZFR的生物学功能，进行了功能实验。采用CircRNA下拉、CircRNA免疫沉淀（circRIP）和Co-I免疫沉淀（Co-IP）分析来研究circZFR功能的分子机制。

结果：在功能上，circZFR敲除抑制增殖、侵袭和肿瘤生长。此外，circRNA下拉实验结合质谱揭示了circZFR与单链DNA结合蛋白1（SSBP1）的相互作用。在机械上，circZFR与SSBP1结合，从而促进CDK2/cyclin E1复合物的组装。CDK2/cyclin E1复合物的激活可诱导p-Rb磷酸化，从而释放活化的E2F1，导致细胞周期进展和细胞增殖。

结论：我们的发现首次证明了circZFR是一种新的癌细胞核糖核酸，可能是宫颈癌患者潜在的生物标记物和治疗靶点。

关键词：细胞周期调控；宫颈癌；环状RNA；RNA免疫沉淀；RNA结合蛋白。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
宫颈癌组织中CircZFR的上调。a。CircRNAs表达谱分析。根据我们的LCHI队列和GEO数据库中的GSE102686数据，宫颈癌组织（T）与配对相邻非癌组织（N）中上调的circRNAs谱的热图。在这两个队列中，CircZFR（hsa_circ_0072088，hsa_carcRNA_103809）在宫颈癌中显著上调。LCHI：辽宁省肿瘤医院和研究所，FC：折叠变化b。维恩图。c。的基因组基因座ZFR公司使用不同的circZFR引物对PCR产物进行基因和Sanger测序，证实了头-尾剪接（外显子13和17）。d。qRT-PCR测定，宫颈癌（CC）中circZFR的水平显著高于邻近正常（AN）和正常宫颈（N）。e、。circZFR在大多数宫颈癌（CC）中的差异表达高于邻近正常组织（AN）（86.7%，26/30）。f、。qRT-PCR检测30例宫颈癌患者及癌旁正常人circZFR的丰度。g、。通过受试者操作特征（ROC）分析评价circZFR对宫颈癌的诊断价值***P（P）< 0.001. AUC：曲线下面积，CI：置信区间
图2
图2
CircZFR促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。a。qRT-PCR分析稳定表达circZFR或control-circZFR（circ-Ctrl）的HeLa和SiHa细胞中circZFR-表达。b-c。通过稳定表达circZFR上调circZFR增加了HeLa和SiHa细胞的增殖能力，如通过CCK-8测定和EdU测定所测量的（比例尺=200 微米）。d。集落形成实验表明，稳定的circZFR过表达增加了HeLa和SiHa细胞的克隆形成能力。例如。伤口愈合和跨孔基质凝胶迁移和侵袭试验表明，circZFR的稳定过度表达增强了HeLa和SiHa细胞的迁移和侵袭（比例尺e（电子）= 200 μm，标尺英寸如果和克= 50 微米）。小时。流式细胞术（FCM）检测到circZFR过度表达后，细胞周期G0-G1期细胞数量显著减少，S期细胞数量增加*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01***P（P）< 0.001
图3
图3
下调circZFR抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。a。使用靶向circZFR结合区（sh-circ）或对照shRNA（sh-Ctrl）的三种不同shRNA，对稳定的cirZFR敲除后HeLa细胞中circZFR-表达进行qRT-PCR分析。Sh2-circ（以下简称sh-circ）表现出最高的击倒效果。b。稳定表达sh-circ或sh-Ctrl的HeLa和SiHa细胞中的CircZFR表达水平。c-d。通过稳定表达sh-circZFR下调circZFR抑制HeLa和SiHa细胞的增殖能力，如CCK-8分析和EdU分析所测（比例尺=200 微米）。e、。集落形成实验表明，稳定敲除circZFR可抑制HeLa和SiHa细胞的克隆形成能力。f-h。通过伤口愈合和跨阱基质凝胶迁移和侵袭试验（比例尺：如果= 200 μm，标尺英寸克和小时= 50 微米）。i、。稳定敲除circZFR后，用流式细胞仪分析细胞周期。CircZFR敲除G0-G1期阻滞细胞，减少S期*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001
图4
图4
E2F1通路的CircZFR激活促进了宫颈癌的进展。a。热图显示基因发生改变（折叠变化> 2,P（P）< 根据TCGA和GTEx数据库，宫颈癌与正常组织的比较。红色表示较高，绿色表示较低。b。使用Cytoscape/BINGO软件进行基因富集。宫颈癌中共有14个上调基因在DNA复制、细胞周期进程和细胞增殖的生物过程中得到富集。c。qRT-PCR检测了稳定过度表达circZFR或circ-Ctrl的HeLa和SiHa细胞中14个候选基因的相对mRNA表达。mRNA表达CCNB1公司,CCNA2号机组,CDC25A型,CDC6型、和TFDP1型在circZFR过度表达后增加。d。E2F1、E2F4和EGR1被鉴定为CCNB1公司,CCNA2号机组,CDC25A型,CDC6型、和TFDP1型使用ChIPbase*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01***P（P）< 0.001
图5
图5
CircZFR诱导Rb磷酸化和E2F1乙酰化。a-b类。在过度表达circZFR或circ-ZFR敲除（sh-circ）的HeLa和SiHa细胞以及相应的对照（分别为circ-Ctrl和sh-Ctrl）中检测到p-Rb S608和S807、ac-E2F1 K117和K125、E2F1、cyclin-E1/−D1和CDK4/2蛋白水平。这些蛋白质的相对强度通过ImageJ（右面板）进行量化。c。肿瘤（T）和配对正常组织（N）中检测到p-Rb S608和S807、ac-E2F1 K117和K125、cyclin-E1和CDK2。d。使用ImageJ软件检测30例宫颈癌患者配对点图中每个蛋白的相对强度。分析采用了双尾配对Student t检验。e、。circZFR的表达与细胞周期蛋白p-Rb和ac-E2F1的相关性。皮尔逊相关系数（r）和第页使用GraphPad Prism 7.0软件执行值*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001
图6
图6
CircZFR促进CDK2/cyclin-E1和CDK2/SSBP1组装，并与SSBP1相互作用。一.i的模型n vivo circRNA下拉使用MS2标记系统，并进行以下无标签质谱（MS）分析。b使用qRT-PCR分析确认circZFR的过度表达。c（c）.circZFR-MS2的共转染GFP公司和MS2-CP-Flagm樱桃色诱导MS2 RNA发夹表达的质粒，其具有过度表达的circZFR和可识别MS2 RNA发夹的融合蛋白MS2-CP-Flag（比例尺=200 微米）。绿色荧光标记的圆圈ZFR（上）和红色荧光标记的MS2-CP-Flag（下）。d日.Western Blot测试MS2-CP-Flag被反旗拉下（向上）。通过qRT-PCR检测circZFR在具有MS2 CP Flag的复合物中的富集（底部）。化验两次，一式三份。e（电子）使用无标签MS测试含有MS2-CP-Flag的蛋白质复合物。肽与SSBP1匹配。如果circRNA免疫沉淀（circRIP）分析，用于测量稳定过度表达的circZFR和circ-Ctrl的HeLa和SiHa细胞中SSBP1和IgG抗体所抑制的circZFR数量。化验两次，一式三份。克从稳定过度表达circZFR或circZFR-敲除（sh-circ）的HeLa细胞制备的裂解物和相应的对照物（分别为circ-Ctrl和sh-Ctrl）使用抗CDK2进行免疫沉淀**P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001，MS2-CP：MS2噬菌体外壳蛋白，MS：质谱，GFP：绿色荧光蛋白，circRIP：circRNA免疫沉淀
图7
图7
CircZFR促进宫颈癌细胞在体内的生长。a。裸鼠皮下注射2 × 107稳定过表达的circZFR和相应的对照HeLa细胞(n个每组10个），21天后取出肿瘤 天。b。图a中的肿瘤体积每3个测量一次 天。c。测量图a中肿瘤的重量。d。裸鼠皮下注射2 × 107稳定敲除circZFR和相应的对照HeLa细胞（每组10个），21天后取出肿瘤 天。e、。图d中的肿瘤体积每3次测量一次 天。f、。测量图d中肿瘤的重量。g、。circZFR-介导的p-Rb磷酸化促进宫颈癌G1/S转变和细胞增殖的模型****P（P）< 0.0001
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