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.2021年5月；10(5):743-755.
doi:10.1002/sctm.20-0468。 Epub 2021年1月29日。

植入后单倍体外胚层干细胞的高通量筛选显示Hs3st3b1是重编程的调节剂

钱高 1, 张文浩 1, 赵一丁 1, 雅鲁田 1, Yuna Wang（王玉娜） 1, 张金鑫 1, 耿梦阳 1, 梅旭 1, 姚春梦 1, 王浩宇 1, 李芦媛 1, Yan Liu（刘燕） 2, 凌帅 1 3 4
附属公司

植入后单倍体外胚层干细胞的高通量筛选显示Hs3st3b1是重编程的调节剂

钱高等。 干细胞Transl Med. 2021年5月.

摘要

来自植入后外胚层的外胚层干细胞（Epiblast stem cells，EpiSCs）是多能干细胞，在表观遗传学上与胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）不同，后者广泛用于重编程研究。最近在哺乳动物物种中获得的单倍体细胞系，由于其纯合表型，为高通量遗传筛选开辟了一个新时代。在这里，我们报道了在胚胎第6.5天（E6.5）从植入后嵌合胚胎中产生小鼠单倍体EpiSCs（haEpiSCss）。这些细胞维持一组染色体，表达EpiSC特异性基因，并有分化为三个胚层的潜能。我们还用haEpiSC开发了一个大规模诱变方案，随后使用这个全基因组突变库进行重编程选择。牵涉到与各种途径相关的多个模块。验证实验证明，敲除Hst3st3b1（候选基因之一）可以有效地促进EpiSCs重编程到基态。我们的结果揭示了利用haEpiSCs阐明包括细胞命运改变在内的基本生物过程的可行性。

关键词：CRISPR；区别；外胚层干细胞；重新编程。

PubMed免责声明

利益冲突声明

所有作者都声明没有潜在的利益冲突。

数字

图1
图1
haEpiSC的建立。A、 来自haESCs的E6.5嵌合胚胎图像；比例尺=100 微米。B、 E6.5外胚层的外生长图像；比例尺=100 微米。C、 haEpiSC和WT‐二倍体EpiSC的菌落；比例尺=100 微米。D、 haEpiSCs（19）的染色体扩散分析 + 十） 和WT‐二倍体EpiSCs（38 + XX年）；比例尺=10μm。E、 对WT‐二倍体EpiSCs进行碘化丙啶（PI）染色后进行DNA含量分析（左面板），对haEpiSCs进行第一次分类（中面板），并建立haEpiSC（右面板）。第一次分选haEpiSCs和已建立的haEpiSC中1n（G0/G1）峰的百分比分别为13.7%和21.9%。F、 haEpiSC和haESCs的细胞周期谱。haEpiSCs中G0/G1、S和G2/M期的百分比分别为27.2%、39.1%和33.7%，haESCs中的百分比分别是17.6%、58.1%和24.3%。G、 分别用两种抑制剂（PD0325901，ERK抑制剂，抑制FGF通路；SB431542，TGFβ抑制剂，抑制激活素/结节通路）处理3周后haEpiSC集落的形态学变化 天。DMSO被用作空白对照。比例尺=100 微米。H、 多能者的表达水平(10月4日)和EpiSC标记基因(节点和FGF5公司)在抑制剂治疗后的haEpiSC中。t吨测试***P（P）< .001.数据表示为平均值 ± 以男性129Sv/Jae肾脏DNA为对照，在log2碱基尺度上对haEpiSCs（haEpi 1‐1和haEpi5‐1）进行SEM.I、CNV分析
图2
图2
haEpiSCs的分子和转录组特征。A、 多能性表达水平(10月4日和纳克)和EpiSCs特异基因(节点,FGF5公司、和氯化物6)qPCR检测haEpiSCs和野生型WT二倍体EpiSCs。数据表示为平均值 ± SEM.B，haEpiSCs和haESCs中TFE3的免疫荧光。DNA用DAPI染色。比例尺=50 微米。C、 haEpiSC和WT‐二倍体EpiSCs中H3K27me3的免疫荧光（XX）。DNA用DAPI染色。比例尺=50 微米。D、 的表达式级别Xist公司和Tsix公司qPCR检测haEpiSCs、雌性ESCs和雌性EpiSCs。t吨测试**P（P）< .001中***P（P）< .001.数据表示为平均值 ± SEM.E，haEpiSCs、WT-二倍体EpiSC的RNA‐seq数据的主成分分析（PCA），第53页KO‐二倍体EpiSCs（来源于第53页‐KO外胚层）、WT‐EpiLC（EpiLC来源于培养物中分化的WT-ESCs），第53页KO‐haEpiLC（衍生自差异化第53页KO‐haESCs in culture）、WT‐ESCs、haESCs和MEF。结果表明，haEpiSC在PC1和PC2轴上均接近WT二倍体EpiSC，而远离WT EpiLC和第53页KO‐二倍体haEpiLCs。F、 haEpiSCs和haESCs中差异表达的基因本体
图3
图3
haEpiSCs的分化潜能。A、 haEpiSCs和haESCs中NANOG的免疫荧光。DNA用DAPI染色。比例尺=50 微米。B、 haEpiSCs中OCT4的免疫荧光。DNA用DAPI染色。比例尺=50 微米。C、 量化10月4日haEpiSCs和haESCs中的远端增强子（DE）和近端增强子报告基因活性。相对荧光素酶活性归一化为空载体的活性。数据表示为平均值 ± SEM.D，EpiSCs特异性表达水平(FGF5公司和氯化物5)，多能性(10月4日和纳克)和分化基因(Cdx2,英国标准普尔4、和内斯汀)在由qPCR测定的haEpiSCs 1‐1和haEpiSC s 5‐1衍生的EB中。haEpiSC作为对照。t吨测试***P（P）< .001.数据表示为平均值 ± SEM.E，haEpiSCs神经分化细胞培养中PAX6的免疫荧光。DNA用DAPI染色。比例尺=50 微米。F、 haEpiSCs神经分化细胞培养中SOX1和TUJ1的双重免疫染色。DNA用DAPI染色。比例尺=50 微米。G、 haEpiSCs神经分化细胞培养中SOX1和TUJ1阳性细胞的百分比。SOX1为57.7%，TUJ1为3%。H、 神经谱系特异性基因的表达水平(内斯汀,第6页、和Tuj1号机组)在haEpiSCs的神经分化细胞培养中，通过qPCR测定分化细胞和WT-NSC（来源于大脑）。t吨测试*P（P）< .05.数据表示为平均值 ± SEM.I，PGCLC诱导第4天haEpiSCs衍生聚集体的形态。比例尺=100 微米。J、 来自haEpiSCs的4天聚集物中整合素β3（CD61）和SSEA‐1阳性细胞的FACS分析。K、 苏木精和伊红染色鉴定的haEpiSCs形成的畸胎瘤。比例尺=100 微米。白色箭头表示肠上皮（内胚层）、肌肉（中胚层）和神经组织（外胚层）。五十、 来自GFP标记的haEpiSCs和haESCs的E6.5嵌合胚胎的形态。比例尺=100 微米。白色箭头表示EXE，虚线表示Epiblast
图4
图4
用于haEpiSCs重编程的正向基因筛查。A、 基于PB的基因陷阱载体在haEpiSCs中的基因筛查示意图。B、 haEpiSCs和haESCs的SSEA‐1免疫荧光。DNA用DAPI染色。比例尺=50 微米。C、 转染后haEpiSCs的亮场和FITC图像。比例尺=100 微米。D、 N2B27/2iL培养基中重组细胞的形态。比例尺=100 微米。E、 在N2B27/2iL培养基中培养的突变haEpiSCs（M‐haEpiSC）和WT‐haEpiSCs中SSEA‐1阳性细胞的百分比。激活素A中培养的WT-haEpiSCs + bFGF培养基作为阴性对照。F、 来自突变haEpiSCs的rESCs的形态。比例尺=100 微米。G、 KEGG分析了插入频率最高的前100个基因。H、 插入位点最多的前10个基因列表
图5
图5
的验证Hs3st3b1型‐重新编程分析的剔除（KO）。A、，Hs3st3b1型KO-3#、KO-5#和KO-7#亚克隆中的基因型缺失。B、 多能干细胞的表达水平(10月4日和雷克斯1)和EpiSC标记基因(氯化物6)英寸Hs3st3b1KO EpiSC。t吨测试**P（P）< .01, ***P（P）< .001.数据表示为平均值 ± SSEA‐1阳性细胞的SEM.C、FACS分析Hs3st3b1型KO EpiSCs和野生型（WT）-EpiSCs。WT‐EpiSCs和Hs3st3b1型KO EpiSC（KO-3#、KO-5#和KO-7#）分别为40.4%、47.9%、58.1%和53.3%。MEF用作阴性对照。D、 N2B27/2iL培养基中重编程分析的示意图。E、 N2B27/2iL介质中从KO-3#、KO-5#和KO-7#导出的rESC图像。比例尺=100 微米。F、 淘汰后的承诺测试Hs3st3b1型在重新编程的第20天。碱性磷酸酶（AP）染色用于观察ESC集落。G、 幼稚标记基因的表达水平(雷克斯1,纳克,斯特拉、和Klf4公司)在中Hs3st3b1KO rESCs公司。t吨测试*P（P）< .05, **P（P）< .05中***P（P）< .001.数据表示为平均值 ± 扫描电镜
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