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.2020年11月5:23:577-591。
doi:10.1016/j.omtn.2020.10.44。 eCollection 2021年3月5日。

HDAC1介导的HIF1α去乙酰化通过促进miR-224-3p介导的FOSL2抑制来防止动脉粥样硬化进展

王浩（Hao Wang） 1 2, 杉本一郎 3 2, 郝璐 1, 杨万勇 1, 刘纪跃 1, 杨洪宇 1, 岳伯松 3, 董燕 3, 邹天宇 4, 斯申 1
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HDAC1介导的HIF1α去乙酰化通过促进miR-224-3p介导的FOSL2抑制来防止动脉粥样硬化进展

王浩（Hao Wang）等。 摩尔热核酸. .

摘要

考虑到组蛋白脱乙酰化酶1（HDAC1）介导的低氧诱导因子1α（HIF1α）脱乙酰化的整体参与，我们旨在确定微RNA（miR）-224-3p在动脉粥样硬化中内皮细胞（EC）凋亡和活性氧（ROS）积累中的功能相关性。预测并验证了miR-224-3p与类Fos抗原2（FOSL2）之间的结合亲和力。此外，我们调控了氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的内皮细胞中miR-224-3p、FOSL2、HDAC1和HIF1α的表达，旨在阐明其对细胞活性、炎症和ROS水平的影响。此外，我们在ApoE中检测了miR-224-3p对高脂肪诱导动脉粥样硬化模型中主动脉粥样斑块和病变的影响-/-老鼠。临床动脉粥样硬化样品和ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞（HAEC）表现出低HDAC1/miR-224-3p表达和高HIF1α/FOSL2表达。miR-224-3p通过靶向FOSL2抑制EC细胞凋亡、炎症反应和细胞内ROS水平。HIF1α降低miR-224-3p表达，加速EC凋亡和ROS积累。此外，HDAC1通过去乙酰化抑制HIF1α的表达，从而增强miR-224-3p的表达，以减轻EC凋亡和ROS积累。miR-224-3p过度表达减少动脉粥样硬化病变体内总之，HDAC1过度表达可通过脱乙酰化HIF1α增强miR-224-3p介导的FOSL2抑制的抗动脉粥样硬化和内皮保护作用，突显出对实验性动脉粥样硬化的新治疗见解。

关键词：FOSL2；HDAC1；HIF1α；动脉粥样硬化；内皮细胞凋亡；miR-224-3p；活性氧物种。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
miR-224-3p在动脉粥样硬化组织中的表达较差。通过qRT-PCR检测正常动脉和动脉粥样硬化病变组织中miR-224-3p的表达，并将其归一化为U6。N=62.*与对照组或空白组相比p<0.05。细胞实验独立重复三次。miR，microRNA；定量逆转录聚合酶链反应；氧化低密度脂蛋白；人主动脉内皮细胞；AL，动脉粥样硬化病变。
图2
图2
miR-224-3p抑制ox-LDL诱导的HAEC中的凋亡和ROS积累（A）RT-qPCR检测的ox-LDL-诱导的HAECs中miR-224-3p的表达，归一化为U6。用NC-mimic、miR-224-3p模拟物、NC-抑制剂或miR-224-3p抑制剂转染ox-LDL诱导的HAEC。（B） 流式细胞术检测ox-LDL诱导的HAEC的凋亡。（C） 通过CCK-8检测ox-LDL诱导的HAEC的增殖。（D） 使用ROS检测试剂盒测量ox-LDL诱导的HAEC中的ROS水平。（E） 用ELISA测定ox-LDL诱导的HAEC中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。∗第页 < 0.05 与。空白组。 #第页 < 0.05 与.NC-mimic小组。 $第页 < 0.05 与NC禁止器组。实验独立重复三次。miR，microRNA；氧化低密度脂蛋白；人主动脉内皮细胞；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；CCK-8，细胞计数试剂盒-8；活性氧；肿瘤坏死因子-α；IL-1β、IL-1β；IL-6、IL-6；酶联免疫吸附试验；NC，阴性对照；方差分析；外径，光密度。
图3
图3
miR-224-3p靶向并下调FOSL2（A）下游靶基因的KEGG功能富集分析结果。横坐标指GeneRatio，纵坐标指KEGG条目。右侧的直方图表示色阶。（B） miR-224-3p与FOSL2-3′UTR的结合位点。（C） 使用双荧光素酶报告基因分析检测293T细胞中的荧光素酶活性（人类）。*与NC-mimic组相比，p<0.05。（D） 使用双荧光素酶报告基因分析在293T细胞中检测荧光素酶活性（小鼠）。*与NC-mimic组相比，p<0.05。（E） 根据GAPDH标准化的qRT-PCR检测HAEC中FOSL2的mRNA表达。*与NC-mimic组相比，p<0.05。#与NC抑制剂组相比，p<0.05。（F） 通过western blot分析检测的HAEC中FOSL2的蛋白表达，归一化为GAPDH。（G） 经qRT-PCR检测的临床血管样本中FOSL2的mRNA表达，归一化为GAPDH，n=62.*与对照组相比p＜0.05。（H） 通过western blot分析检测的临床血管样本中FOSL2的蛋白表达，归一化为GAPDH，n=62。（一） 根据GAPDH标准化的qRT-PCR检测动脉粥样硬化细胞模型中FOSL2的mRNA表达。*与空白组相比p＜0.05。（J） 通过western blot分析检测动脉粥样硬化细胞模型中FOSL2的蛋白表达，并将其归一化为GAPDH。（K） 临床动脉粥样硬化样本中FOSL2和miR-224-3p表达的Pearson相关分析。细胞实验独立重复三次。FOSL2、Fos样抗原2；KEGG，《京都基因和基因组百科全书》；3′UTR，3′非翻译区；mRNA、信使RNA；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；WT，野生型；MUT，突变型。
图4
图4
miR-224-3p通过靶向FOSL2（A）抑制ox-LDL诱导的HAEC中的细胞凋亡和ROS积累。经western blot分析检测，ox-LDL-诱导的HAECs中凋亡相关蛋白（cleaved-PARP、cleaved caspase-3和Bax）的表达符合GAPDH标准。（B） ELISA检测ox-LDL诱导的HAEC上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。（C） 使用ROS检测试剂盒测量ox-LDL诱导的HAEC中的ROS水平。（D） 流式细胞术检测ox-LDL诱导的HAEC的凋亡。（E） 通过CCK-8分析检测ox-LDL诱导的HAEC的增殖。*与oe-NC组相比，p<0.05。#与oe-NC+miR-224-3p模拟组相比，p<0.05。实验独立重复三次。聚ADP-核糖聚合酶；Bax、Bcl-2相关X蛋白；oe，过表达；Bcl-2，B细胞淋巴瘤-2。
图5
图5
HIF1α抑制ox-LDL诱导的HAECs中的细胞凋亡和ROS积累（A）通过qRT-PCR检测正常动脉（对照组）和动脉粥样硬化病变中HIF1α的表达，并将其归一化为GAPDH。n=62.*与对照组相比p<0.05。（B） 通过qRT-PCR检测HIF1α在ox-LDL诱导的HAEC中的表达，并将其归一化为GAPDH。*与空白组相比p<0.05。（C） HIF1α对miR-224-3p的2个启动子区域的影响的双核糖核酸酶基因报告子分析结果。（D） 通过qRT-PCR检测不同处理对ox-LDL诱导的HAEC中HIF1α、miR-224-3p和FOSL2的表达，并将其归一化为U6或GAPDH。（E） 通过western blot分析检测ox-LDL诱导的HAEC中凋亡相关蛋白（cleaved-PARP、cleaved caspase-3和Bax）的表达，并将其归一化为GAPDH。（F） ELISA检测ox-LDL诱导的HAEC上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。（G） 使用ROS检测试剂盒检测ox-LDL诱导的HAEC中的ROS水平。（H） CCK-8法检测ox-LDL诱导的HAEC的增殖。（一） 流式细胞术检测ox-LDL诱导的HAEC的凋亡。在面板（C）和（E）–（H）中，与si-NC组相比，*p<0.05。#与si-HIF1α+NC抑制剂组相比，p<0.05。在（H）中，使用重复测量ANOVA对各组内基于时间的测量进行统计分析，然后进行Bonferroni的事后检验。细胞实验独立重复三次。HIF1α、缺氧诱导因子-1α；si，小干扰RNA。
图6
图6
HDAC1诱导HIF1α去乙酰化，增加miR-224-3p的表达，从而抑制ox-LDL诱导的HAEC（A和B）中的细胞凋亡和ROS积累。通过qRT-PCR和western blot分析检测临床样本（n=62）和动脉粥样硬化细胞模型中HDAC1的表达。（C） 通过coIP检测HDAC1在HIF1α启动子区的富集。*与IgG相比p<0.05。#与oe-NC组相比，p<0.05。（D） 通过IP检测HDAC1调节HIF1α的乙酰化水平。（E） 通过qRT-PCR检测HIF1α、miR-224-3p和FOSL2的表达，归一化为U6或GAPDH。（F） 通过western blot分析检测ox-LDL诱导的HAEC中凋亡相关蛋白（cleaved-PARP、cleaved caspase-3和Bax）的表达，并将其归一化为GAPDH。（G） ELISA检测ox-LDL诱导的HAEC上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。（H） 使用ROS检测试剂盒检测ox-LDL诱导的HAEC中的ROS水平。（一） CCK-8法检测ox-LDL诱导的HAEC的增殖。（J） 流式细胞术检测ox-LDL诱导的HAEC的凋亡。在面板（E）和（G）–（J）中，*与oe-NC组相比，p<0.05。#与oe-HDAC1组相比，p<0.05。细胞实验独立重复三次。组蛋白脱乙酰酶1；免疫沉淀；IgG，免疫球蛋白G。
图7
图7
miR-224-3p上调减轻小鼠动脉粥样硬化（A）通过qRT-PCR测定小鼠主动脉组织中HDAC1、HIF1α、miR-224-3p和FOSL2的表达（n=10）。（B） western blot分析测定的小鼠主动脉组织中HDAC1、HIF1α和FOSL2水平，归一化为GAPDH（n=10）。（C） 载脂蛋白E油红O染色−/−小鼠主动脉组织（n=10）。（D） 主动脉病变的定量观察（n=10）。（E） 通过western blot分析测定小鼠主动脉组织中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 3和cleaved-PARP的蛋白表达。（F） 小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平（n=10）。*与ND+NC组相比，p＜0.05。#与HFD+NC组相比，p<0.05。实验独立重复三次。H&E、苏木精和曙红；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；ND，正常饮食；HFD，高脂肪饮食。
图8
图8
HDAC1介导的HIF1α脱乙酰化上调miR-224-3p以减少动脉粥样硬化中ROS积累和EC凋亡
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