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.2021年1月26日；34(4):108680.
doi:10.1016/j.celrep.2020.108680。

Chk1通过ASF1A的直接磷酸化促进G1中非同源末端的连接

李京勇（Kyung Yong Lee） 1, 安妮迪亚·杜塔 2
附属公司

Chk1通过ASF1A的直接磷酸化促进G1中非同源末端的连接

李敬勇等。 单元格代表. .

摘要

细胞周期阶段是DNA双链断裂、非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）时修复途径选择的主要决定因素。Chk1在S/G2期对基因毒性应激作出反应，但在这里，我们报道了Chk1直接促进G1期NHEJ修复的作用。ASF1A是一种组蛋白伴侣，但它通过一种独立于其组蛋白-受体活性的途径促进NHEJ。共济失调毛细血管扩张症突变（ATM）激酶激活的Chk1通过Ser-166处ASF1A的直接磷酸化促进NHEJ。Ser-166磷酸化的ASF1A与修复蛋白MDC1相互作用，从而增强MDC1与ATM的相互作用以及ATM在DNA断裂时的稳定定位。Chk1缺乏抑制了G1中DNA断裂后MDC1下游的所有步骤，即组蛋白泛素化、53BP1定位到DNA断裂和NHEJ。因此，Chk1的ASF1A磷酸化对NHEJ在G1中修复DNA断裂至关重要。

关键词：53BP1；ASF1A；Chk1；DSB修复；G1细胞周期；MDC1；NHEJ；组蛋白泛素化；非同源端接；磷酸化。

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利益冲突声明

利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.Ser-166处的ASF1A磷酸化是其与DSB上MDC1相互作用所必需的
（A） 人类C末端ASF1A和ASF1B的保守性较差，以及（C）中使用HA标记的ASF1A的C末端缺失突变体。（B） 在DSB存在的情况下，MDC1与ASF1A而非ASF1B的相互作用。20µg/mL博莱霉素处理1小时后，用抗HA抗体结合珠免疫沉淀HEK293T细胞中的HA标记的ASF1A或ASF1B。免疫沉淀和裂解物的免疫印迹显示。EV，空向量；1A，HA-ASF1A；1B，HA-ASF1B。（C） C-末端ASF1A与MDC1相互作用所需的160–170个氨基酸。按照DSB标记物（B）.pATM中的描述进行免疫沉淀（IP）。（D） ASF1A中Ser-166的拟磷酸突变促进其与MDC1的相互作用。将HA-ASF1A的野生型（WT）、Ser166Ala（S166A）或Ser166Glu（S166E）突变体应用于IP。（E）体外拟磷酸ASF1A与MDC1重组FHA结构域的结合。MDC1（aa 1–158）的重组GST或GST标记的FHA结构域与his-tagged ASF1A的重组WT或S166突变体孵育，然后用谷胱甘肽珠免疫沉淀，然后对所示抗体进行免疫印迹。
图2。
图2.ASF1A中的拟磷酸S166E突变促进了53BP1在DSB的定位和NHEJ修复
（A） 当内源性ASF1A被siASF1A耗尽时，WT或S166突变体的异位表达使DSB上的γH2AX保持不变。转染对照siRNA（siGL2）或siASF1A后，稳定表达siRNA-resistant WT或S166突变体的U2OS中全细胞提取物的免疫印迹。用10µg/mL博莱霉素处理细胞1小时（B和C）。在siASF1A转染细胞中，通过抗siRNA-的WT或ASF1A的S166E拯救53BP1病灶。显示了代表性图像（B）和定量（C）。固定前用10µg/mL博莱霉素处理细胞1h，并对超过20个病灶的细胞进行计数。三份样品的平均值±SD。Tukey事后检验后的单因素方差分析****p<0.0001。内源性ASF1A耗竭后，ASF1A的S166突变体的异位表达使（D和E）MDC1病灶在DSB上保持不变。（E）中计数了10个病灶以上的细胞。三份的平均值±标准差。比例尺，10µm。（F和G）在缺乏ASF1A的NHEJ/DsRed293B细胞中，通过Ser-166的磷酸化ASF1A拯救NHEJ效率。稳定表达抗siRNA的ASF1A突变体WT或S166的293B或293B细胞转染有指示的siRNA和HA-I-SceI质粒。293B裂解物的免疫印迹如（F）所示，并且如STAR方法所述测量（G）中的NHEJ效率。三份样品的平均值±SD。Tukey事后检验后的单因素方差分析**p＜0.01***p<0.001****p<0.0001。（H） S166A ASF1A减缓博来霉素脉冲处理后γH2AX的降低。用siASF1A转染稳定表达siRNA-resistant WT或S166突变体的U2OS细胞，然后在脉冲处理20µg/mL博莱霉素1 h后的指定时间点收集整个细胞提取物。用博来霉素处理5小时后通过集落形成测量生存能力。三份样品的平均值±SD。
图3。
图3 ASF1A中的拟磷酸S166E突变通过ATM促进MDC1磷酸化和DSB处MDC1-RNF8相互作用促进组蛋白泛素化
（A和B）磷酸化ATM在S1981（pS1981）的DSB定位在ASF1A的S166磷酸化突变存在时促进。具有5个以上病灶的细胞的代表性图像（A）和量化（B）。三份的平均值±标准差。单向方差分析（Tukey的事后检验）**p＜0.01***p<0.001****p<0.0001。比例尺，10µm。（C） ASF1A的S166E突变允许MDC1的ATM磷酸化。用HA标记的MDC1质粒转染稳定表达WT或S166突变体的ASF1A敲除293B细胞，并在收获前用20µg/mL博莱霉素处理2 h。所示为使用抗HA抗体和裂解物的免疫沉淀物的免疫印迹。（D） ASF1A的S166E突变促进MDC1-RNF8相互作用。用HA标记的MDC1和siASF1A转染稳定表达siRNA-resistant WT或S166突变体的HEK293T细胞。（E） DSB后ASF1A的S166E突变促进组蛋白泛素化。收集siASF1A转基因的U2OS稳定细胞，异位表达siRNA-resistant WT或S166突变体，并用指示的抗体对这些组蛋白提取物（左）或全细胞提取物（右）进行免疫印迹。H2A免疫印迹是这两种药物的负荷对照。
图4。
图4.Chk1磷酸化DSB上ASF1A的Ser-166
（A） 使用抗pS166抗体对ASF1A中磷酸化S166的特异性识别。HEK293T中的HA-ASF1A WT或S166A突变体经免疫沉淀并用指示的抗体进行免疫印迹。pS166，抗磷酸化S166抗体。（B） DSB上ASF1A中磷酸化S166的增加。将EV或HA-ASF1A WT质粒转染的HEK293T细胞与10µg/mL博莱霉素孵育14 h。（C）重组ASF1A用作底物的示意图在体外激酶分析。pS166需要（D和E）ATM和Chk1。指示的siRNA在具有HA-ASF1A WT瞬时表达的HEK293T细胞中以24小时间隔转染两次。（F）Chk1直接磷酸化ASF1A的S166在体外.体外按照STAR方法进行Chk1激酶检测。反应中的Chk1激酶活性和S166磷酸化分别通过重组Chk1和ASF1A的放射标记追踪。处理1µM UCN-01以抑制Chk1活性。
图5。
图5 Chk1通过促进H2AX上的组蛋白泛素化和G1期DSB上的53BP1定位促进NHEJ，并且自身被ATM激活
（A） NHEJ维修需要Chk1。如图2G所示测量NHEJ效率，并通过从对照组（siGL2或DMSO）中减去每个siRNA或抑制剂处理的值来计算NHEJ的效率降低。293B细胞用siGL2或指示的siRNA转染两次，间隔24小时。分别在收获前20 h和5 h添加5µM MK-8776和600 nM UCN-01。三份样品的平均值±SD。（B和C）Chk1抑制减少G1和S/G2细胞中的53BP1病灶。用20µM MK8776处理U2OS细胞1 h，然后再用20μg/mL博莱霉素处理1 h。显示了周期蛋白A阴性（G1）和阴性（S/G2）细胞（C）中53BP1病灶阳性细胞的典型图像（B）和定量。虚线中的细胞表示细胞周期蛋白A阴性细胞。三份样品的平均值±SD。单向方差分析（Tukey的事后检验）**p<0.01****p<0.0001。比例尺，10µm。（D） 组蛋白泛素化在DSB G1期被Chk1抑制而非S/G2期被抑制。用20µM MK8776处理U2OS细胞1小时，然后在富含G1或S/G2的细胞中再使用20µg/mL博莱霉素处理1小时。S296（pS296-Chk1）处Chk1的自磷酸化减少，用作Chk1活性的测量。（E） DSB G1期Chk1的ATM依赖性磷酸化。通过荧光激活细胞分选（FACS）分析，HeLa DR13–9细胞在诺可唑释放后，20µg/mL博莱霉素作用1小时，在G1期积累。（F） ASF1A与MDC1的相互作用需要Chk1活性和G1期S166磷酸化。用HA-ASF1A WT或S166A质粒转染HEK293T细胞，并通过诺卡唑释放在G1中积累。500 nM UCN-01处理1 h，然后进行博莱霉素处理。在S695（pS695-TLK1）处TLK1磷酸化降低被用作Chk1失活的措施。（G） ASF1A与Chk1在G1期共免疫沉淀，但在S期不共免疫沉淀。
图6。
图6 Chk1缺乏症中NHEJ、H2AX上的组蛋白泛素化和DSB上53BP1定位的抑制通过Ser-166的磷酸类似物ASF1A缓解
（A） 通过在G1细胞中表达ASF1A WT或S166E，可以恢复被Chk1抑制的ATM抑制的MDC1磷酸化。使用诺卡唑释放的HEK293T细胞进行具有抗IgG或抗MDC1抗体的IP。在G1累积的293T细胞中处理DMSO或20µM MK8776。1小时后，20µg/mL博莱霉素在收获前处理2小时。（B） 通过表达S166E恢复Chk1抑制中被抑制的MDC1-RNF8相互作用。用MK8776和博来霉素连续1h处理具有或不具有WT或S166稳定表达突变体的异步HEK293T。（C） 通过在具有Chk1抑制的G1细胞中过表达ASF1A的WT或S166E来拯救组蛋白泛素化。使用诺卡唑释放的U2OS细胞和DMSO或MK8776进行酸性组蛋白提取。硝化纤维膜的蓬索染色显示富集组蛋白作为负荷控制，S期组蛋白提取物和全细胞提取物的免疫印迹如图S4所示。（D和E）通过ASF1A WT或S166E过度表达G1细胞中Chk1抑制来拯救53BP1病灶。显示了G1（E）中53BP1病灶阳性细胞的代表性图像（D）和定量。计数超过10个病灶的细胞。比例尺，10µm。三份样品的平均值±SD。单向方差分析（Tukey的事后检验）*p<0.05**p＜0.01***p<0.001****p<0.0001。（F） 在Chk1缺乏症中通过ASF1A的S166E表达拯救NHEJ效率。用siChk1和HA-I-SceI质粒转染稳定表达ASF1A WT或S166突变体的293B细胞。293B裂解物的免疫印迹如图S4所示。三份样品的平均值±SD。Tukey事后检验后的单因素方差分析***p<0.001****p<0.0001。（G） 提出了Chk1通过G1期ASF1A磷酸化在NHEJ修复中的作用模型。详细信息见讨论。
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