Phenotypical Characterization of the Nuclear Egress of Recombinant Cytomegaloviruses Reveals Defective Replication upon ORF-UL50 Deletion but Not pUL50 Phosphosite Mutation

doi:10.3390/v13020165

.2021年1月22日；13(2):165.

doi:10.3390/v13020165。

重组巨细胞病毒核出口的表型特征显示ORF-UL50缺失后复制缺陷，但pUL50磷脂酶突变未发现

附属公司

¹德国爱尔兰根纽伦堡弗里德里希·阿莱克山德大学临床和分子病毒学研究所（FAU），邮编：91054。
²德国汉诺威30625，汉诺威医学院病毒学研究所。
^三乌尔姆大学医学中心病毒研究所，德国乌尔姆89081。
⁴德国埃尔兰根91054，埃尔兰根大学医学中心（FAU）眼科。

PMID： 33499341
预防性维修识别码：项目管理委员会7911381
内政部： 10.3390/v13020165

重组巨细胞病毒核出口的表型特征显示ORF-UL50缺失后复制缺陷，但pUL50磷脂酶突变未发现

Sigrun Häge公司等。病毒. 2021.

.2021年1月22日；13(2):165.

doi:10.3390/v13020165。

附属公司

¹德国爱尔兰根纽伦堡弗里德里希·阿莱克山德大学临床和分子病毒学研究所（FAU），邮编：91054。
²德国汉诺威30625，汉诺威医学院病毒学研究所。
^三德国乌尔姆89081乌尔姆大学医学中心病毒学研究所。
⁴德国埃尔兰根91054，埃尔兰根大学医学中心（FAU）眼科。

PMID： 33499341
预防性维修识别码： PMC7911381
内政部： 10.3390/v13020165

摘要

核出口是调节核质衣壳释放的常见疱疹病毒过程。对于人巨细胞病毒（HCMV），核出口复合物（NEC）由pUL50-pUL53核心决定，该核心调节与NEC相关蛋白和衣壳的多组分组装。最近，对α-、β-和γ-疱疹病毒的NEC晶体结构进行了解析，揭示了深刻的结构保守性，然而，初级序列和结合特性并没有反映出这一点。NEC结合原理基于通过N端钩状pUL53突起的钩入槽相互作用，该突起包含α-螺旋pUL50结合槽。到目前为止，pUL50被认为是主要的激酶相互作用决定因素，pUL50-pUL53的大量磷酸化被指定为NEC的形成和功能。在这里，我们讨论了ORF-UL50突变HCMV的表型变化问题。令人惊讶的是，我们的分析没有发现大多数这些病毒突变体的主要复制缺陷，涉及复制动力学参数（qPCR）、病毒蛋白生成参数（Western blot/CoIP）和衣壳出口参数（共焦成像/EM）。具体而言，只有ORF-UL50缺失拯救病毒在感染后期表现出基因组合成受阻，而所有磷脂酶突变体与野生型或回复型相比表现出微小差异。这些结果（i）强调了pUL50对核出口的速率限制功能，以及（ii）证明了所有映射的pUL50磷酸位点中的突变可以得到很大程度的补偿。一个精练的机制概念指向一个多方面的核出口调控，为此讨论了对pUL50表达和磷酸化的依赖性。

关键词：ORF-UL50删除；堆芯核出口复合体；差异功能关联；人巨细胞病毒；pUL50磷脂酶突变体；表型变化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。

数字

图1
本研究中使用的ORF-UL50结构的示意图。对于名为“删除（ΔUL50）假名”的结构，使用Red重组从HB15 BACmid中删除ORF-UL50，而不影响pUL49/pUL50重叠区域（nt 1151-1194以浅灰色突出显示；[19]）。通用转移构建体（UTCs，插入pcDNA3.1质粒载体）的构建基于野生型UL50-HA，其包含Red重组所需的同源区（HR）、I-SceI限制性位点和卡那霉素盒（aphAI）。通过定点突变产生的丝氨酸/苏氨酸替换突变体（5个主要的磷酸位点S188、T214、S216、S300、S324和9个次要的磷酸位点S95、T174、T183、S225、S227、S229、S251、S268、S330）被称为P×5和P×14（5或14个丙氨酸替换突变）或M×5和M×14（5或14个磷酸化模拟突变，在相同位置携带谷氨酸替代物）。分别使用两个对应的回复子Rev1和Rev2作为P×5/M×5和P×14/M×14突变体的对照结构，并额外产生一个单位点突变体S216A进行比较。HA-tag以蓝色突出显示，终止密码子以红色突出显示。使用这些UTC进行BAC重组的详细信息如图S1所示。

图2
重组HCMVΔUL50病毒蛋白表达分析。正常HFF生长在6孔板（4×10⁵细胞/孔），用于生产亲代HCMV AD169（WT）和重组HCMVΔUL50的初级感染上清液。这些上清液用作正常HFF或HFF-UL50−Dox/+Dox细胞感染的接种物（相同体积为1 mL/孔），以确定与ΔUL50相比HCMV WT的表达模式。在指示的时间点（h p.i.）分析蛋白质表达，并使用相应抗体进行Western blotting（Wb）。请注意，与pUL50诱导细胞（>，+Dox）相比，使用ΔUL50接种物（*，−Dox）获得的感染性和病毒蛋白产量（即使在96小时p.i.之后）存在显著的数量差异，尤其是在未诱导细胞（*，–Dox）中。

图3
HCMV pUL50磷酸位点突变体的病毒蛋白表达分析。HFF感染了亲代或重组HCMV，MOI为0.3。在p.i.注射4天后分析蛋白质表达，并使用指示的抗体进行Wb。(A类)重点放在主要的磷脂酶突变体P×5和M×5上，或(B类)突变体包括P×14和M×14中的主要和次要磷酸化位点替换。注意，如文中所述，pUL53和pUL50水平降低，后者由两个独立的实验复制品描述，标记为pUL50（I）和（II）。(C类)HCMV感染HFF的总裂解物在30°C下任选地用lambda磷酸酶（PP）处理45分钟，并进行Phos-tag SDS-PAGE和Wb；*，磷酸化形式的pUL50。

图4
HCMVΔUL50或pUL50磷酸位点突变产生的病毒蛋白定位的共焦成像分析。使用正常HFF或pUL50-互补细胞（HFF-UL50+Dox）感染重组HCMV，MOI为0.05，并于第7天采集。使用针对所示蛋白质的抗体进行免疫荧光染色，并给出共焦成像的代表性面板（参见面板E中的比例尺，图28）。(A类–C类)病毒蛋白pUL53、pUL44和MCP，显示HFF中HCMVΔUL50的定位模式发生改变（参见插图a和b以及用填充白色箭头标记的定位改变表型，与用框架白色箭头标记正常/未改变的定位相比）。(天,E类)病毒蛋白pUL97、IE1和pp28，显示定位模式没有改变。图S4提供了更多信息。

图5
ORF-UL50缺失突变体的HCMV复制动力学。HFF-UL50细胞(A类)或HFF(B类,C类)用亲代HCMV AD169（WT）或重组HCMVΔUL50感染，MOI为0.01或0.001。HFF-UL50细胞中pUL50的表达要么未被诱导（−Dox），要么被诱导（+Dox）。病毒上清液(A类–C类)或单元格(C类)在指定的时间点采集，通过IE1特异性ddPCR测定病毒基因组当量(A类,B类)或qPCR(C类). 每次感染至少进行三次；显示了平均值和标准偏差。根据WT（实线）计算显著性。含有10个HCMV DNA拷贝的标准品在第38周期达到了周期阈值，因此被定义为qPCR的检测限，如黑色虚线所示。ddPCR是一种二进制端点测量，可以检测到一个拷贝；*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01.

图6
pUL50磷酸位点突变体的HCMV复制动力学。HFF用亲代HCMV AD169（WT）或重组HCMV磷酸化位点突变体P×14、M×14、Rev2、P×5、M×5、Rev1或S216A感染，MOI为0.01或0.001。病毒上清液(A类–天)或单元格(天)在指定的时间点采集，通过IE1特异性qPCR测定病毒基因组当量。每次感染至少进行三次；显示了平均值和标准偏差。根据Rev2或WT（实线）计算显著性。含有10个HCMV DNA拷贝的标准品在第38周期达到了周期阈值，因此被定义为qPCR的检测限，如黑色虚线所示。*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01.

图7
病毒核衣壳形成的电镜分析。如MOI所示，HFF感染了亲本WT、突变或回复HCMV，MOI适应于保持细胞活力，以便在每次4–7天采集和固定，然后在TEM中进行切片和阴性染色。(A类)A、B和C衣壳的代表。(B类)在16700倍或33400倍（c，f）放大倍数下，感染细胞的代表性细胞核。描述了A-（白色三角形）、B-（白色箭头）和C-衣壳（白色箭头带黑色尾巴）的分布。NE，核膜；细胞质；Nuc；细胞核。(C类)HCMVΔUL50衣壳在核包膜附近的累积，而WT的分布更均匀（放大25050倍）。

图8
核内衣壳类型的定量评估。有关感染（4-7 d.p.i.）和样本制备的详细信息，请参见图7。(A类)TEM计数由研究人员单独进行，一式两份(n个=4–8），每种病毒最多使用九个核切片。给出了A、B和C衣壳的平均值±SD，以占计数衣壳总数的百分比表示。(B类)上述平均值的图示。

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