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.2021年1月4日:2021:8836818。
doi:10.1155/2021/8836818。 eCollection 2021年。

刺激Sigma-1受体通过减轻IRE1通路和自噬损伤保护心肌纤维化

附属公司

刺激Sigma-1受体通过减轻IRE1通路和自噬损伤保护心肌纤维化

荆曲等。 氧化介质细胞Longev. .

摘要

Sigma-1受体(Sig1R)是内质网(ER)膜上的伴侣蛋白,与心肌肥厚有关;然而,其在心脏成纤维细胞活化中的作用尚未确定。本研究通过对小鼠进行假手术、横主动脉收缩(TAC)和TAC加氟伏沙明(Sig1R激动剂)治疗,研究了Sig1R与这种激活之间的可能联系。四周后通过超声心动图和组织学染色评估心功能和纤维化。在一个在体外研究中,新生大鼠心脏成纤维细胞在存在或不存在转化生长因子β1(TGF)的情况下,用氟伏沙明或NE-100(Sig1R拮抗剂)治疗-β1) 。然后通过qPCR、western blotting、免疫荧光、共焦显微镜和透射电镜研究纤维化标记物、内质网应激途径和自噬。氟伏沙明治疗减少了心脏纤维化,保留了心脏功能,并减弱了心脏成纤维细胞的活化。IRE1/XBP1通路是内质网应激的一个分支,通过一种特异性IRE1内切酶抑制剂对其进行抑制,可以减弱病理过程。氟伏沙明刺激Sig1R可恢复心脏成纤维细胞的自噬流量,表明Sig1R似乎通过抑制IRE1通路和恢复自噬通量,在激活心脏成纤维纤维细胞中发挥保护作用。因此,Sig1R可能代表心脏纤维化的治疗靶点。

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数字

图1
图1
横行主动脉缩窄(TAC)手术后,Sig1R在小鼠心脏组织中下调。将小鼠随机分为假手术组和TAC组。(a,b)通过超声心动图显示的EF百分比(射血分数)和FS(缩短分数)评估心功能下降和心肌肥厚;舒张期IVS(室间隔)和LVPW(左室后壁)厚度。n个= 6; (c) 心脏肥厚指数,HW/BW(心脏重量与体重之比)。n个= 6; (d,e)苏木精/伊红染色心肌细胞的代表性横断面图像。比例巴=50μ米。n个= 6. (f–i)心脏切片用天狼星红和马森三色染色,以显示纤维化(红色和蓝色)。比例巴=50μ米。n个= 6. (j) COL-1(I型胶原)、POSTN(骨膜炎素)、,α-座椅模块组件(α-平滑肌肌动蛋白)、CTGF(结缔组织生长因子)和TGF-β(转化生长因子-β)在小鼠心脏组织中。n个= 6; (k,l)POSTN的蛋白质水平,α-座椅模块组件(α-平滑肌肌动蛋白)、CTGF和TGF-β在小鼠心脏组织中。n个= 6; (m–o)小鼠心脏组织中Sig1R(Sigma-1受体)的mRNA和蛋白质水平。n个= 6. 所示为代表性图片;统计显著性由unparied确定t吨-测试。第页< 0.05,∗∗第页< 0.01,∗∗∗第页< 0.001. 数据表示平均值±SEM。
图2
图2
TGF诱导心肌成纤维细胞活化中Sig1R下调-β1.将心脏成纤维细胞随机分为两组。(a) COL-1、POSTN、CTGF和TGF的q-PCR结果-β在对照组和TGF的心脏成纤维细胞中-β1次治疗(转化生长因子-β)组。n个= 4; (b,c)POSTN、CTGF和TGF的代表性蛋白质印迹结果-β在对照组和TGF的心脏成纤维细胞中-β1治疗(TGF-β)组。n个= 3; (d) 的代表性图像α-心脏成纤维细胞的SMA荧光显示(绿色荧光表示α-SMA和蓝色荧光表明细胞核被DAPI染色)。比例巴=20μ米,n个= 100; (e,g)通过EdU分析评估心脏成纤维细胞的增殖率(红色荧光表示包含EdU的细胞,蓝色荧光表示Hoechst 33342染色的细胞核)。比例巴=100μ米,n个= 200; (f,h)显示心脏成纤维细胞迁移的划痕伤口愈合试验;图像拍摄于0和24h后刮擦。黑线表示伤口边界。比例巴=100μ米。n个= 6; (i–k)通过q-PCR评估Sig1R的mRNA水平。n个= 4; (j,k)来自对照组和TGF的心脏成纤维细胞中Sig1R的典型western blot结果-β1治疗(TGF-β)组。n个= 3; (l) 显示心脏成纤维细胞Sig1R荧光的代表性图像(绿色荧光表示Sig1R表达,蓝色荧光表示DAPI染色的细胞核)。比例巴=5μ米。n个= 50. 所示为代表性图片,第页由未成对确定t吨-测试。第页< 0.05,∗∗第页< 0.01,∗∗∗第页< 0.001. 数据表示平均值±SEM。
图3
图3
刺激Sig1R可减弱心脏成纤维细胞的激活。心脏成纤维细胞被随机分为四组:对照组、转化生长因子组-β、FLV和FLV+TGF-β.(a,b)POSTN、CTGF和TGF的代表性蛋白质印迹结果-β在来自对照的心脏成纤维细胞中,TGF-β1治疗(TGF-β)组、氟伏沙明治疗组(FLV)或氟伏沙胺联合TGF组-β1次治疗(FLV+TGF-β)组。n个= 3; (c) 的代表性图像α-不同组心脏成纤维细胞的SMA荧光。比例巴=20μ米。n个= 100; (d,f)用EdU法评估不同组心脏成纤维细胞的增殖率。比例巴=100μ米,n个= 200; (e,g)不同组心脏成纤维细胞划痕创面愈合试验;图像拍摄于0和24h后刮擦。黑线表示伤口边界。比例巴=100μ米。n个= 6; 所示为代表性图片,第页采用单因素方差分析进行评估。第页< 0.05,∗∗第页< 0.01,∗∗∗第页< 0.001. 数据表示平均值±SEM。
图4
图4
抑制Sig1R进一步促进心脏成纤维细胞活化。心脏成纤维细胞被随机分为四组:对照组、TGF组-β、NE-100和NE-100+TGF-β1.(a,b)POSTN、CTGF和TGF的代表性蛋白质印迹结果-β在对照组的心脏成纤维细胞中,TGF-β1治疗(TGF-β)NE-100治疗组(NE-100)或NE-100联合TGF组-β1次治疗(N+TGF-β)组。n个= 3; (c) 免疫荧光染色的代表性显示α-不同组心脏成纤维细胞中的SMA(绿色)。比例巴=20μ米,n个=100(d,f)通过EdU分析评估来自不同组的心脏成纤维细胞的增殖率。比例巴=100μ米,n个= 200; (e,g)不同组心脏成纤维细胞划痕创面愈合试验;图像拍摄于0和24h后刮擦。黑线表示伤口边界。比例巴=100μ米。n个= 6. 所示为代表性图片,第页通过单因素方差分析确定。第页< 0.05,∗∗第页< 0.01,∗∗∗第页< 0.001. 数据表示平均值±SEM。
图5
图5
Sig1R的siRNA进一步促进心脏成纤维细胞活化;使用Sig1R激动剂氟伏沙明治疗可减少TAC术后4周的心脏纤维化并保持心脏功能。小鼠被随机分为三组:Sham、TAC和FLV。(a、b)POSTN、CTGF、Sig1R和TGF的蛋白质水平-β用Sig1R siRNA转染活化的心脏成纤维细胞。n个= 3; (c,d)通过超声心动图评估心脏功能和肥厚,以EF和FS百分比表示;舒张IVS和LVPW厚度。n个= 6; (e,f)心脏图像和心肌肥厚指数,HW/BW,n个= 6; (g,j)苏木精/伊红染色心肌细胞的代表性横断面图像。比例巴=50μ米。n个= 6. (h、i、k和l)心脏组织的天狼星红和马森三色染色的代表性图像显示纤维化(红色和蓝色)。比例巴=50μ米。n个= 6; (m) COL-1、POSTN、CTGF和TGF的mRNA水平-β在小鼠心脏组织中。n个= 6; (n,o)FN(纤连蛋白)、POSTN、CTGF和TGF的蛋白水平-β在小鼠心脏组织中。n个= 6. 所示为代表性图片,第页通过单因素方差分析确定数值。第页< 0.05,∗∗第页< 0.01,∗∗∗第页< 0.001. 数据表示平均值±SEM。
图6
图6
Sig1R通过抑制内质网应激来防止心脏纤维化。(a,b)p-PERK,p-IRE1的代表性蛋白质印迹结果α对照组、TGF的心脏成纤维细胞中的ATF4、XBP1和c-ATF6-β1治疗(TGF-β)组、氟伏沙明治疗组(FLV)或氟伏沙胺联合TGF组-β1次治疗(FLV+TGF-β)组。n个= 3; (c,d)p-PERK,p-IRE1的代表性蛋白质印迹结果α对照组、TGF的心脏成纤维细胞中的ATF4、XBP1和c-ATF6-β1治疗(TGF-β)NE-100治疗组(NE-100)或NE-100联合TGF组-β1次治疗(N+TGF-β)组。n个= 3; (e,f)p-PERK,p-IRE1的代表性蛋白质印迹结果α假手术组、TAC组和TAC组后腹腔注射氟伏沙明的心脏组织中的ATF4、XBP1和c-ATF6。n个= 6; (g,i)对照组、thapsigargin仅治疗组(Th)、氟伏沙明治疗组和Thapsijargin联合氟伏沙胺治疗组(Th+FLV)心脏成纤维细胞中POSTN和CTGF的典型western blot结果。n个= 3; (h,j)来自对照组、仅4-PBA治疗组(4-PBA)、NE-100治疗组(NE-100)和NE-100联合4-PBA处理组(N+4-PBA)的心脏成纤维细胞中POSTN和CTGF的典型western blot结果。(k,l)不同组心脏成纤维细胞中POSTN和CTGF的蛋白水平。n个=3。所示为代表性图片,第页该值通过Tukey事后分析的单向方差分析确定。第页< 0.05,∗∗第页< 0.01,∗∗∗第页< 0.001. 数据表示平均值±SEM。
图7
图7
Sig1R通过减轻自噬流量损伤来防止心脏纤维化。(a,b)来自对照的心脏成纤维细胞中LC3和p62的代表性蛋白质印迹结果,TGF-β1治疗(TGF-β)组、氟伏沙明治疗组(FLV)或氟伏沙胺联合TGF组-β1次治疗(FLV+转化生长因子-β)组。n个= 3; (c,d)对照组TGF心脏成纤维细胞中LC3和p62的典型western blot结果-β1治疗(TGF-β)NE-100治疗组(NE-100)或NE-100联合TGF组-β1次治疗(N+TGF-β)组。n个= 3; (e,f)sham-operated(sham)、TAC和TAC(FLV)组后腹腔注射氟伏沙明的小鼠心脏组织中LC3和p62的典型western blot结果。n个= 6; (g,h)通过共焦显微镜观察mRFP-GFP-LC3表达细胞。用Pearson相关系数评估RFP和GFP的合并荧光,每组20个细胞用于定量。比例巴=5μm.所示为代表性图片,第页该值通过Tukey事后分析的单向方差分析确定。第页< 0.05,∗∗第页< 0.01,∗∗∗第页< 0.001. 数据表示平均值±SEM。
图8
图8
Sig1R通过调节自噬来防止心脏纤维化。透射电镜观察到心脏成纤维细胞中有代表性的自噬体图像。比例尺:10μm和4μ米。
图9
图9
Sig1R通过调节IRE1通路和自噬流量防止心肌纤维化的示意图。在压力过负荷诱导的心脏纤维化或TGF中-β1诱导的心脏成纤维细胞活化触发内质网应激和自噬损伤。氟伏沙明对TAC小鼠或TGF激活的心脏成纤维细胞Sig1R的刺激作用-β1减少纤维化细胞外基质(ECM)基因表达和心脏纤维化。

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引用人

工具书类

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