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.2021年1月20日；12(1):487.
doi:10.1038/s41467-020-20679-y。

BNIP3L/NIX介导的有丝分裂对糖皮质激素诱导的突触缺陷的保护作用

吉恩·崔 1, 李贤治 2 三, Chang Woo Chae公司 1, 赵智贤（Ji Hyeon Cho） 1, 年轻的玄贞 1, 金俊成（Jun Sung Kim） 1, Seo Yihl Kim先生 1, 林在龙 1, 何在翰 4
附属公司

BNIP3L/NIX介导的有丝分裂对糖皮质激素诱导的突触缺陷的保护作用

吉恩·崔等。 国家公社. .

摘要

应激诱导的糖皮质激素干扰线粒体生物能量学和动力学；然而，受损的线粒体不是通过有丝分裂被清除，而是积累起来。因此，我们研究了糖皮质激素在海马神经元、SH-SY5Y细胞和ICR小鼠的有丝分裂抑制和随后的突触缺陷中的作用。首先，我们观察到糖皮质激素由于抑制线粒体自噬而降低突触密度和囊泡循环。筛选数据显示，糖皮质激素下调BNIP3-样（BNIP3L）/NIX，导致线粒体呼吸功能和突触密度降低。值得注意的是，我们发现糖皮质激素直接引导糖皮质激素受体与PGC1α启动子直接结合，下调其表达和核移位。PGC1α下调选择性降低NIX依赖性的有丝分裂。与这些结果一致，NIX增强子预处理暴露于皮质酮的小鼠可提高海马区的线粒体和突触密度，改善空间记忆任务的结果。总之，糖皮质激素通过下调NIX抑制有丝分裂，NIX激活是恢复突触功能的潜在靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。糖皮质激素可导致线粒体定位错误、突触功能障碍和细胞死亡。
一——c（c）用皮质酮和皮质醇处理海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 h、 分别是。海马神经元用MAP2（绿色）、Tau（蓝色）和Mitotracker红（MTR，红色）进行免疫染色。在远端神经突中量化皮尔逊相关系数的相对比率（100 微米）。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5b条海马神经元用突触素（绿色）、DAPI（蓝色）和TOMM20（红色）进行免疫染色。定量分析了核周区线粒体强度和突触素与TOMM20的皮尔逊相关系数。比例尺，100 μm（放大倍数，×200）。n个 = 5c（c）用TOMM20（绿色）和DAPI（蓝色）对SH-SY5Y细胞进行免疫染色。测量细胞核和四肢周围的线粒体强度。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5d日——小时海马神经元用皮质酮治疗48 小时。d日海马神经元用MAP2（绿色）和DAPI（蓝色）进行免疫染色，以测量树突的长度。比例尺，100 μm（放大倍数，×200）。n个 = 5e（电子）海马神经元用突触素（绿色）和PSD95（红色）进行免疫染色。Pearson相关系数用于检测突触密度。比例尺，100 μm（放大倍数，×200）。n个 = 5（f）进行Western blot。n个 = 5克用去极化缓冲液刺激细胞后，用突触素-1抗体孵育细胞，然后固定。突触体素（绿色）用于突触可视化，突触凝集素-1（红色）用于测量突触小泡的摄取。比例尺，100 μm（放大倍数，×200）。n个 = 5小时条件化海马神经元用FM4-64染色并用高钾刺激+用于卸载的缓冲区。时间推移成像完成时间超过180 秒，间隔1秒。n个 = 5我用皮质醇处理SH-SY5Y细胞72 h.通过Annexin V/PI分析分析凋亡细胞（AnnexinV阳性细胞）的百分比，并用流式细胞仪测量。n个 = 5.所有印迹和免疫荧光图像都具有代表性。n个 = 5个来自独立实验，每个实验有两个技术副本。定量数据以平均值±标准误差表示。典型图像由SRRF成像系统采集。双方未成对学生的t吨进行了测试。*，**表示第页 < 0.05,第页 < 0.01与对照组。数据作为源数据文件提供。
图2
图2。皮质醇和皮质醇抑制线粒体自噬。
一,b条在DIV 5用线粒体靶向Keima（mt-Keima）转染海马神经元，而SH-SY5Y细胞转染mt-Kemma 48 治疗前h。羰基氰化物3-氯苯肼（CCCP，10 μM）和抗霉素A1（1 μM）预处理2 h.皮质酮和皮质醇治疗24小时 h分别在DIV 14和SH-SY5Y细胞的海马神经元中。观察到mt-Keima的绿色和红色荧光。DAPI用于核复染（蓝色）。量化红色与红色和绿色之和的比率。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5c（c）,d日在DIV 5用自噬感觉（GFP）和DsRed2-Mito（RFP）转染海马神经元。用两个相同的载体转染SH-SY5Y 48 治疗前h。皮质酮和皮质醇治疗24小时 h分别在DIV 14和SH-SY5Y细胞的海马神经元中。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5.量化GFP和RFP荧光之间的皮尔逊相关系数。e（电子）——我用皮质酮和皮质醇处理海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 h、 分别是。e（电子）,（f）两种细胞类型均用MTR（红色）染色30 min，然后用甲醛固定。随后进行TUNEL分析。用FITC过滤器检测DNA断裂。线粒体FITC荧光定量为线粒体死亡。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5克,小时实时荧光定量PCR分析线粒体DNA（mtDNA）和nDNA水平。ACTB公司用作加载控件。n个 = 5我巴菲尔霉素A1（10 nM）适用于2 收获前h。western blot分析海马神经元TOMM20表达和LC3II/I比值。负载控制为β-肌动蛋白。n个 = 5.所有印迹和免疫荧光图像都具有代表性。n个 = 5个来自独立实验，每个实验有两个技术副本。定量数据以平均值±S.E.M表示。代表性图像通过SRRF成像系统采集。双方未成对学生的t吨除图2a、b和2i外，均进行了测试，其数据通过双向方差分析进行了分析。**表示第页 < 0.01与对照组。NS表示不显著。数据作为源数据文件提供。
图3
图3。糖皮质激素独立于PINK1-parkin通路抑制NIX表达。
一SH-SY5Y细胞与皮质醇孵育12 通过实时PCR分析h和mRNA的表达。n个 = 5b条,c（c）用皮质酮处理海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 h和皮质醇分别用于不同时间。western blot检测NIX、PTEN诱导激酶1（PINK1）和BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）的表达。n个 = 5d日,e（电子）分别用皮质酮和皮质醇处理海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 h.观察NIX（绿色）、TOMM20（红色）和DAPI（核染色，蓝色）。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5（f）非目标（NT）或停车场2siRNA转染SH-SY5Y细胞24小时，皮质醇转染24小时 h.NIX与帕金共同免疫沉淀。对免疫沉淀样品中的帕金水平进行定量。n个 = 5克,小时用线粒体靶向Keima（mt-Keima）-Red-Parkin转染海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 皮质酮和皮质醇治疗24小时前 h、 分别是。进行Western blot。n个 = 5我——我海马神经元和SH-SY5Y细胞均用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA，10 nM）30 皮质酮和皮质醇治疗24分钟前 h、 分别是。我,j个将mt-Keima在DIV 5和48转染海马神经元和SH-SY5Y细胞 分别在治疗前h。DAPI用于核复染（蓝色）。量化红色与红色和绿色之和的比率。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5k个,我western blot检测TOMM20水平。n个 = 5米用pcDNA3.1/c-eGFP或pcDNA3.11/NIX-c-eGFP载体转染SH-SY5Y细胞24小时 皮质醇治疗24小时前 h.用western blot检测TOMM20水平。n个 = 5.所有的印迹和免疫荧光图像都具有代表性。n个 = 5个来自独立实验，每个实验有两个技术副本。定量数据以平均值±标准误差表示。典型图像通过SRRF成像获得。双方未成对学生的t吨测试：图3a，b，d，e.双面单向方差分析：图3c。双面双向方差分析：图3f–m。**表示第页 < 0.01与对照组。## 表示第页 < 0.01与海马神经元的皮质酮和SH-SY5Y的皮质醇相比。数据作为源数据文件提供。
图4
图4。NIX上调可恢复糖皮质激素诱导的线粒体功能障碍。
一,b条海马神经元用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA，10 nM）30 皮质酮治疗24分钟前 h.用pcDNA3.1/c-eGFP或pcDNA3.11/NIX-c-eGFP载体转染SH-SY5Y细胞24小时 皮质醇治疗24小时前 h.通过MitoSOX染色和光度计测量mtROS水平。n个 = 5c（c）——d日海马神经元用PMA（10 nM）30 皮质酮48分钟前 h.用pcDNA3.1/c-eGFP或pcDNA3.11/NIX-c-eGFP载体转染SH-SY5Y细胞24小时 皮质醇治疗前48小时 h.用光度计通过四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染色测量线粒体膜电位。n个 = 5e（电子）——小时用PMA预处理海马神经元和SH-SY5Y细胞30 皮质酮和皮质醇治疗48分钟前 h、 分别是。用Seahorse SF24细胞外通量分析仪测量了寡霉素、羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯肼（FCCP）和抗霉素A/鱼藤酮混合物处理后线粒体应激试验下的耗氧率（OCR）变化。n个 = 5.还提供了基础呼吸、最大呼吸、ATP生成和质子泄漏的统计数据。我——k个海马神经元用PMA预处理30 皮质酮48分钟前 小时。我western blot检测突触素和PSD95。负载控制为β-肌动蛋白。n个 = 5j个用去极化缓冲液刺激后，用突触凝集素-1抗体孵育细胞。突触体素（绿色）用于突触可视化，突触凝集素-1（红色）用于测量突触小泡的摄取。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5k个条件化海马神经元用FM4-64染色并用高钾刺激+用于去训练的缓冲区。延时成像超过180次 1秒 Eclipse Ts2的秒间隔TM（TM）荧光显微镜。n个 = 5.所有印迹和免疫荧光图像都具有代表性。n个 = 5个来自独立实验，每个实验有两个技术副本。定量数据以平均值±标准误差表示。典型图像由SRRF成像系统采集。进行双侧双向方差分析。*, **表示第页 < 0.05,第页 < 0.01与对照组。#,##表示第页 < 0.05,第页 < 与海马神经元中的皮质酮和SH-SY5Y中的皮质醇相比分别为0.01。数据作为源数据文件提供。
图5
图5。GR-依赖性抑制有丝分裂。
一——d日非目标（NT）或希腊siRNA转染海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 皮质酮和皮质醇治疗24小时前 h、 分别是。一,b条在DIV 5用线粒体靶向Keima（mt-Keima）转染海马神经元，而SH-SY5Y细胞转染mt-Kemma 48 治疗前h。观察到mt-Keima的绿色和红色荧光。DAPI用于核复染（蓝色）。量化红色与红色和绿色之和的比率。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5c（c）——d日western blot检测TOMM20水平。负载控制为β-肌动蛋白。n个 = 5.所有印迹和免疫荧光图像都具有代表性。n个 = 5个来自独立实验，每个实验有两个技术副本。定量数据以平均值±标准误差表示。典型图像由SRRF成像系统采集。进行双侧双向方差分析。*, **表示第页 < 0.05,第页 < 0.01与对照组。#,##表示第页 < 0.05,第页 < 海马神经元的皮质酮和SH-SY5Y的皮质醇分别为0.01和0.01。数据以源数据文件的形式提供。
图6
图6。GR依赖性通过PGC1α下调NIX表达。
一,b条非目标（NT）或希腊siRNA转染海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 皮质酮和皮质醇治疗24小时前 h、 分别是。用β-肌动蛋白作为负荷对照，在western blot中检测NIX表达。n个 = 5c（c）SH-SY5Y细胞与皮质醇孵育6 h.通过RT2 Profiler PCR阵列评估与核受体和协同调节因子相关基因的mRNA表达水平。使用Qiagen网站上的GeneGlobe数据分析中心获得了具有层次聚类的热图。n个 = 三。d日第一个密码子上游的1000个碱基对PPARGC1A公司并用黄色标记强调了假定的GRE结合序列。e（电子）SH-SY5Y细胞与皮质醇孵育6 h.用IgG、RNA聚合酶（RNAPol）和糖皮质激素受体（GR）抗体免疫沉淀DNA。免疫沉淀和输入样本用以下引物扩增GAPDH公司和PPARGC1A公司基因。n个 = 5.所有斑点都具有代表性。n个 = 3个或5个来自独立实验，每个实验有两个技术副本。定量数据表示为平均值±S.E.M.图6a、b中进行了双侧双向方差分析t吨试验如图6e所示。**表示第页 < 0.01与对照组。##表示第页 < 与海马神经元中的皮质酮和SH-SY5Y中的皮质醇相比分别为0.01。数据作为源数据文件提供。
图7
图7。PGC1α在NIX依赖性有丝分裂中的作用。
一——e（电子）非目标（NT）或希腊siRNA转染海马神经元和SH-SY5Y细胞24小时 皮质酮和皮质醇治疗12小时前 h、 分别是。一,b条western blot检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC1α）的表达，其中β-肌动蛋白被用作两种细胞类型的负荷控制。n个 = 5c（c）利用SRRF成像系统观察海马神经元中PGC1α（红色）和DAPI（蓝色）的颜色化。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5d日利用SRRF成像系统观察SH-SY5Y中PGC1α（绿色）和DAPI（蓝色）的显色。比例尺，20 μm（放大倍数，×1000）。n个 = 5e（电子）western blotting检测亚细胞组分中PGC1α蛋白的表达。层蛋白A/C和α-微管蛋白分别用作核和细胞溶质负荷控制。n个 = 5（f）,克用pcDNA3.1/c-eGFP或pcDNA3.11/PPARGC1A-c-eGFP载体转染SH-SY5Y细胞24小时 皮质醇治疗24小时前 小时。（f）用β-肌动蛋白作为负荷对照，在western blot中检测NIX表达。n个 = 5克western blot检测TOMM20水平。western blot的负荷控制为β-actin。n个 = 5.所有印迹和免疫荧光图像都具有代表性。n个 = 5个来自独立实验，每个实验有两个技术副本。定量数据以平均值±S.E.M.进行双侧方差分析。**表示第页 < 0.01与对照组相比。#,##表示第页 < 0.05,第页 < 海马神经元的皮质酮和SH-SY5Y的皮质醇分别为0.01和0.01。数据作为源数据文件提供。
图8
图8。皮质酮通过降低体内PGC1α影响NIX依赖的有丝分裂。
一——（f）小鼠暴露于载体皮质酮（10 mg/kg），皮质酮与佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐（PMA预处理，200 μg/kg），或单独服用PMA 7天。一用LAMP1（绿色）、TOMM20（红色）和DAPI（蓝色）对IHC的玻片样品进行免疫染色。比例尺，100 μm（放大倍数，×200）。n个 = 5b条western blot检测NIX、PTEN诱导激酶1（PINK1）和BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）的表达，以β-actin作为负荷对照。n个 = 5c（c）IHC玻片样品用synpatophysin（绿色）、PSD95（红色）和DAPI（蓝色）进行免疫染色。比例尺，100 μm（放大倍数，×200）。n个 = 5d日western blot检测突触素和PSD95。负载控制为β-肌动蛋白。n个 = 5e（电子）小鼠进行Y迷宫实验以评估空间记忆功能。n个 = 6（f）小鼠进行强迫游泳试验以评估抑郁行为。n个 = 5克车辆或RU 486（5 mg/kg）注射小鼠，给予/不给予皮质酮（10 mg/kg）持续3天。通过western blotting观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子1-α（PGC1α）和NIX的表达。负载控制为β-肌动蛋白。n个 = 5小时显示了糖皮质激素抑制NIX依赖性线粒体自噬的机制示意图。所有斑点和免疫荧光图像都具有代表性。n个 = 从每只动物身上取5或6只，分别进行两次技术复制，以获得IHC和western blot结果。定量数据以平均值±标准误差表示。典型图像由SRRF成像系统采集。除图8b外，还进行了双侧双向方差分析，其数据由双侧非配对学生的t吨测试。**表示第页 < 0.01与对照和##表示第页 < 分别为0.01和皮质酮。数据作为源数据文件提供。
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