Single-cell analysis reveals the intra-tumor heterogeneity and identifies MLXIPL as a biomarker in the cellular trajectory of hepatocellular carcinoma

doi:10.1038/s41420-021-00403-5

.2021年1月18日；7（1）:14。

doi:10.1038/s41420-021-00403-5。

单细胞分析揭示了肿瘤内异质性，并将MLXIPL确定为肝细胞癌细胞轨迹中的生物标记物

肖东^#¹, 范旺^#¹, 刘川¹, 京玲¹, 贾学兵¹, 沈菲菲¹, 宁阳², 朱思波^三, 林忠⁴, 齐丽⁵

附属公司

¹上海交通大学医学院上海总医院肿瘤科，上海，200080。
²第二军医大学上海东方肝胆外科医院肝外科，上海，200438，中国。
^三复旦大学生命科学学院药物基因组学中心，上海，200438，中国。
⁴上海交通大学医学院上海总医院肝胆外科，上海，200080。
⁵上海交通大学医学院上海总医院肿瘤科，上海，200080。leeqi@sjtu.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 33462196
预防性维修识别码：项目管理委员会7814056
内政部： 10.1038/s41420-021-00403-5

单细胞分析揭示了肿瘤内异质性，并将MLXIPL确定为肝细胞癌细胞轨迹中的生物标记物

肖东等。细胞死亡发现. 2021.

.2021年1月18日；7(1):14.

doi:10.1038/s41420-021-00403-5。

作者

肖东^#¹, 范旺^#¹, 刘川¹, 静玲¹, 贾学兵¹, 沈菲菲¹, 宁阳², 朱思波^三, 林忠⁴, 齐丽⁵

附属公司

¹上海交通大学医学院上海总医院肿瘤科，上海，200080。
²第二军医大学上海东方肝胆外科医院肝外科，上海，200438，中国。
^三复旦大学生命科学学院药物基因组学中心，上海，200438，中国。
⁴上海交通大学医学院上海总医院肝胆外科，上海，200080。
⁵上海交通大学医学院上海总医院肿瘤科，上海，200080。leeqi@sjtu.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 33462196
预防性维修识别码：项目管理委员会7814056
内政部： 10.1038/s41420-021-00403-5

摘要

肝细胞癌（HCC）是一种全球流行的癌症，5年生存率低。人们对其复杂的基因表达谱知之甚少。单细胞RNA测序是在更详细的水平上探索肝癌遗传特征的不可或缺的工具。在这项研究中，我们使用Smart seq 2测序方法分析了来自人类HCC肿瘤和癌旁组织的单细胞的基因表达。基于差异表达基因，我们在肝癌组织中鉴定了异质性亚克隆，包括5个肝癌亚克隆和2个肝细胞亚克隆。然后，我们进行hub基因共网络和功能注释分析，然后使用调节转录因子共网络进行伪时间分析，以确定HCC细胞轨迹。我们发现MLX相互作用蛋白样（MLXIPL）在单个细胞和组织中普遍上调，并与肝癌的低存活率相关。从机制上讲，MLXIPL激活对促进细胞增殖和通过加速细胞糖酵解抑制细胞凋亡至关重要。综上所述，我们的工作确定了肝癌亚克隆的异质性，并表明MLXIPL可能是一个有希望的肝癌治疗靶点。

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利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

**图2。单细胞转录水平的肿瘤内异质性。**
A类拷贝数变异（CNV）的染色体景观在转录组上区分恶性细胞和非恶性细胞。红色，放大；蓝色，删除。B类来自六名肝癌患者（患者用颜色表示）的所有405个单细胞的t-SNE图。患者ID命名为PT0X。

**图3。HCC0-4的Hub基因共网络和功能注释（簇0-4）。**
A类HCC0的Hub基因共网络和GOBP功能分析（聚类0）。B类HCC1的Hub基因共网络和GOBP功能分析（簇1）。C类HCC2的Hub基因网络和GOBP功能分析（聚类2）。天HCC3的Hub基因网络和GOBP功能分析（聚类3）。E类HCC4的Hub基因网络和GOBP功能分析（聚类4）。

**图4。细胞轨迹模式及其主要驱动基因。**
A类非监督t-SNE图显示，HCC组织中散在分布着五个HCC簇，癌旁组织中分布着肝细胞。B类五种HCC细胞亚群和癌旁肝细胞的细胞轨迹。t-SNE图显示了单核细胞的分布。C类细胞轨迹的方向由无监督伪时间决定。天细胞轨迹相关转录因子及其调控基因的调控共同网络。黄圈基因是最关键的转录因子。E类与细胞轨迹相关的GOBP功能注释。F类绘图显示了八个关键转录因子在不同亚克隆中的表达谱呈假时间趋势。

**图5。MLXIPL作为一种潜在的生物标志物，与肝癌患者的低生存率相关。**
A类小提琴图显示HCC簇与肝细胞簇相比MLXIPL的mRNA水平。B类,C类采用实时定量PCR和western blotting分析方法检测6例肝癌患者及癌旁组织中MLXIPL蛋白的表达。纳秒*P（P）* > 0.05; **P（P）* < 0.05***P（P）* < 0.01.天采用PCR方法检测68例肝癌患者及癌旁组织中MLXIPL mRNA的表达****P（P）* < 0.001.E类,F类MLXIPL蛋白表达的代表性免疫组织化学图片和IHC评分**P（P）* < 0.05.G公司,**H（H）**基于MLXIPL不同表达水平的Kaplan-Meier生存曲线。J型与L02细胞相比，肝癌细胞中MLXIPL的表达在mRNA水平上显著增加****P（P）* < 0.001.我与L02细胞相比，MLXIPL蛋白在HCC细胞中相对过表达。

**图6。MLXIPL在体外促进HCC增殖并抑制凋亡。**
A类,B类通过定量实时PCR和western blotting检测过表达的MLXIPL质粒或MLXIPL-siRNAs的转染效果***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001.C类MLXIPL在HCC细胞中过度表达并分别敲除后，采用CCK8法检测指示细胞的增殖能力**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01****P（P）* < 0.001.天MLXIPL在HCC细胞中过度表达并分别敲除后，检测指示细胞的凋亡分析。具有代表性的数据显示了左下象限的活细胞（Annexin V‑FITC−/PI−）、右下象限中的早期凋亡细胞（Angexin V−FITC+/PI−）和右上象限中晚期凋亡细胞（Engexin V-FITC+/PI+在左上象限。纳秒*P（P）* > 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001.

**图7。MLXIPL在体外促进HCC细胞糖酵解。**
A类将转染过表达MLXIPL质粒或MLXIPL-siRNAs的SMMC-7721和HepG2细胞培养24小时 h用于葡萄糖摄取分析**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01.B类用过表达的MLXIPL质粒或MLXIPL siRNA转染后SMMC-7721和HepG2中乳酸盐产生的分析**P（P）* < 0.05.C类对转染细胞进行裂解并检测丙酮酸的细胞质水平**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01.天利用海马仪ECAR分析转染SMMC-7721和HepG2细胞的总糖酵解通量。E类,F类定量实时PCR和western blot分析转染过表达的MLXIPL质粒后SMMC-7721和HepG2细胞糖酵解关键酶的水平变化。纳秒*P（P）* > 0.05; **P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001.

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