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.2021年1月13日；22(2):743.
doi:10.3390/ijms2200743。

血凝素蛋白中重要N-连接糖基化位点的鉴定及其对DC-SIGN介导的禽流感H5N1感染的功能影响

Zih-Syuan Yang公司 1 2, 黄素伟（Szu-Wei Huang） 3, 王文洪 1 4, 林志彦 1 2, 王楚峰 5, 阿斯皮罗·纳伊姆·乌尔维纳 1, Arunee Thitithanyanont公司 6, 曾松品 2, 坡梁路 1 4 5, 陈彦旭 1 4, 王生凡 1 2 5 7
附属公司

血凝素蛋白中重要N-连接糖基化位点的鉴定及其对DC-SIGN介导的禽流感H5N1感染的功能影响

Zih-Syuan Yang公司等。 国际分子科学杂志. .

摘要

DC-SIGN是一种主要在树突状细胞（DC）中表达的C型凝集素，据报道可介导多种病毒感染。我们之前报道过DC-SIGN介导的H5N1流感A病毒（AIV）感染，然而，DC-SIGN与N-糖基化位点的重要相互作用仍然未知。本研究旨在确定H5N1-AIV HA蛋白中DC-SIGN相互作用的最佳N-糖基化位点。NetNGlyc程序的结果分析了2004年至2020年间分离株的H5血凝素序列，结果表明，在HA1和HA2结构域中分别检测到7个和2个保守的N-糖基化位点。产生了一种假型A/Vietnam/1203/04型H5N1慢病毒包膜（H5N1-PVs），通过免疫电镜观察显示病毒上含有丰富的HA5蛋白。此外，通过定点突变试验产生了携带一系列N-糖基化突变的H5N1-PV或反向遗传（H5N1-RG）菌株。人重组DC-SIGN（rDC-SIGN）包衣ELISA显示H5N1-PV与DC-SIGNs结合，但N27Q、N39Q和N181Q的突变显著降低了这种结合(第页< 0.05). 感染性和捕获试验表明，N27Q和N39Q突变显著改善了DC-SIGN介导的H5N1感染。此外，联合突变（N27Q和N39Q）显著减弱了H5N1-PV或-RG感染在顺式和中反式(第页< 0.01). 本研究得出结论，N27和N39是DC-SIGN介导H5N1感染的两个关键N-糖基化作用。

关键词：DC-SIGN；H5N1；N-连接糖基化；N27Q；N39Q；血凝素；感染。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
禽H5N1流感病毒HA基因的系统发育分析。通过NCBI流感病毒资源获得了不同支系H5N1禽流感病毒HA核苷酸的全长序列。使用ClustalW软件对禽H5N1病毒完整HA-基因的核苷酸序列进行了比对、编辑和分析。使用MEGA版本X进行系统发育分析(http://www.megasoftware.net/). 共识邻接树是从1000个bootstrap复制中获得的。灰色三角形表示从人类分离出H5N1禽流感毒株。
图2
图2
H5N1型流感病毒HA蛋白的N-连接糖基化分析。HA核苷酸序列全长构成2004年至2020年期间从感染者中分离出的禽流感H5N1病毒。这些序列通过NetNGlyc 1.0 Server预测H5N1流感毒株血凝素的N-连接糖基化。(A类)共检测到9个N-连接的糖基化位点。红线和蓝线分别表示N-连接糖基化的潜在阈值和HA（H5）上预测的N-糖基化位点。(B)HA1结构域中有7个N-糖基化位点（26、27、39、170、181、209、302），其中两个（500和509）位于HA2跨膜结构域。红色单词表示预测的N-连接糖基化的最高百分比和分数。(C类)标记血凝素结构上的每个N-糖基化位点；数字表示相对氨基酸位置。左侧和右侧表示H5N1流感病毒血凝素的单体和三聚体结构。红色和蓝色结构分别表示HA1和HA2结构域。
图3
图3
重组DC-SIGN和H5N1假型病毒的产生。(A类)将带有Fc标记的DC-SIGN质粒编码的胞外糖相互作用域（ECD）转染到Freestyle HEK 293F细胞中，并在37°C、120 rpm和5%CO2的摇床培养箱中再培养48 h。收集上清液并通过蛋白A珠进行进一步纯化。使用抗人IgG（左）或抗DC-SIGN抗体（右）对总裂解产物和纯化的重组DS-SIGN-ECD-Fc蛋白进行免疫印迹，以检查蛋白表达水平。(B)用小鼠抗DC-SIGN抗体对Mock和pDC-SIGN-ECD-Fc转染细胞进行免疫荧光染色，然后添加针对初级抗体的红色荧光标记抗体。用荧光显微镜观察染色细胞。(C类)通过将pNL-Luc-E-R-载体与pHW1203-HA和pHW120 3-NA载体共转染HEK293T细胞，获得H5N1禽伪型病毒（PVs）。转染48小时后收集含有H5N1-PV的细胞上清液。通过超速离心纯化和浓缩后，对病毒粒子进行透射电镜（TEM）和免疫透射电镜（immuno-TEM），免疫透射电镜用抗HA（H5）抗体染色，然后添加针对一级抗体的金标记抗体。(D类)将经唾液酸酶预处理的Raji-DC-SIGN细胞与模拟或H5N1-PVs处理在4°C下孵育2 h，以进行病毒结合，并用抗HA（H5）和抗DC-SIGN抗体进行免疫荧光染色，然后添加绿色（用于HA）和红色（用于DC-SIGN）针对初级抗体的荧光标记抗体，然后进行卡尔蔡司LSM 700共焦显微镜观察。(E类)比较Raji和Raji-DC-SIGN细胞中H5N1、H1N1和H3N2包膜假型慢病毒的感染性。显示了具有代表性的结果。定量数据表示至少三个独立实验结果的平均值±SD(*第页< 0.05; **第页< 0.01).
图4
图4
HA上携带N-糖基化突变的H5N1-PV的产生及其传染性和DC-SIGN相互作用能力的评估。(A类)给出了HA上潜在N-糖基化突变位点的方案。MBCS表明“一个多碱解理位点”(B)使用携带不同N-糖基化突变的H5N1-PV进行血凝试验，并与0.5%火鸡红细胞（PC:季节性H1N1流感分离物；NC:PBS）孵育。材料和方法中描述了详细的程序。(C类)携带不同N-糖基化突变的H5N1-PV的感染性比较。(D类)采用rDC-SIGN-Fc蛋白包被ELISA方法评估携带不同N-糖基化突变的H5N1-PV之间的结合能力。(E类)Sialidase预处理的Raji/Rji-DC-SIGN和THP1-/THP1-DC-SIGN细胞被携带不同N-糖基化突变的H5N1-PV感染。显示了具有代表性的结果。定量数据表示至少三个独立实验结果的平均值±SD(*第页< 0.05; **第页< 0.01).
图5
图5
DC-SIGN介导的评估顺式携带N-糖基化突变的H5N1-PV感染。将携带不同N-糖基化突变的H5N1-PV感染Raji和Raji-DC-SIGN细胞48小时，并进行发光活性测定。WT，野生型。显示了具有代表性的结果。定量数据表示至少三个独立实验结果的平均值±SD(*第页< 0.05; **第页< 0.01).
图6
图6
DC-SIGN介导的评估反式携带N-糖基化突变的H5N1 PV感染。(A类)演示了改进的常规捕获分析方案。(B)Raji和Raji-DC-SIGN被用作捕获细胞。将它们与H5N1-PV在4°C下孵育2 h，然后与MDCK（靶细胞）在37°C下共培养24–48 h。共培养后，通过强化PBS洗涤（三到五次）去除捕获细胞，并对靶MDCK细胞进行发光分析。此外，用于检测从顺式感染后，使用transwell系统监测从捕获细胞释放的病毒，进一步导致MDCK（靶细胞）感染。受感染的MDCK细胞的下通道也进行了发光分析。或者，一些组联合使用IgG对照和抗DC-SIGN单克隆抗体。用共培养MDCK的发光值测量相对感染性，并与transwell系统的MDCK值进行归一化。(C类)将Raji和Raji-DC-SIGN细胞（捕获细胞）与携带HA上不同N-糖基化突变的H5N1-PV在4℃孵育2 h，然后与MDCK（靶细胞）在37℃共培养24–48 h。共培养后，通过强化PBS洗涤（三到五次）去除捕获细胞并对靶MDCK细胞进行发光分析。同样，检测顺式使用上述transwell系统监测捕获细胞的感染。或者，一些组联合使用IgG对照和抗DC-SIGN单克隆抗体。用共培养MDCK的发光值测量相对感染性，并与transwell系统的MDCK值进行归一化。与WT组相比，每个N-糖基化突变体的差异显著。显示了具有代表性的结果。定量数据表示至少三个独立实验（WT、野生型）结果的平均值±SD(*第页< 0.05; **第页< 0.01).
图7
图7
27和39个N-糖基化位点的突变改善了DC-SIGN介导的感染顺式和中变速器。(A类)将单核细胞衍生的未成熟和成熟树突状细胞（iDC和mDC）感染H5N1-RG病毒，在37°C的温度下，HA上携带不同的N-糖基化突变，持续48 h，并进行qRT-PCR分析。通过检测各组中的病毒拷贝数确定相对传染性，并将其归一化为野生型病毒感染的iDC。(B)演示了改进的常规捕获分析方案。(C类)iDC和mDC作为捕获细胞，与携带HA上不同N-糖基化突变的H5N1-RG病毒在4℃孵育2 h，并与MDCK细胞（靶细胞）在37℃共培养18–24 h通过强化PBS洗涤（三到五次）去除MDCK细胞，并对MDCK细胞进行qRT-PCR分析。transwell系统用于监测从顺式感染（从捕获细胞（iDC和mDC）释放的病毒位于上通道）并进一步导致MDCK（靶细胞）（下通道）感染。MDCK细胞接受来自顺式感染者也接受qRT-PCR。用共培养MDCK检测到的病毒拷贝数测定相对传染性，并用transwell系统检测到的MDCK病毒拷贝数进行归一化。(D类)用H5N1-RG野生型或N-糖基化突变体感染iDC和mDC，并在37°C下孵育48 h。使用Annexin V和碘化丙啶染色（WT，野生型）对感染细胞进行凋亡分析。与WT组相比，每个N-糖基化突变体的差异显著。显示了具有代表性的结果。定量数据表示至少三个独立实验（WT、野生型）结果的平均值±SD(*第页< 0.05; **第页< 0.01).
图8
图8
H5N1血凝素蛋白上显示的结构DC-SIGN碳水化合物识别域（CRD）凝集素相互作用域和两个必需的N-糖基化位点的方案。证明了H5N1血凝素结构上DC-SIGN CRD与N27和N39 N-糖基化位点的凝集素相互作用域。使用DS Viewer程序测量N27和N39之间的距离。根据其他地方发布的参考文献，DC-SIGN CRD（PDB 1XAR）中的黄色标记结构表示凝集素结合域[52]。血凝素的绿色和红色标记结构分别表示HA1和HA2（PDB 2FK0）。该图的DC-SIGN CRD和H5结构被手动叠加，而不是显示共晶结构结果。
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