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.2021年1月13日；22(2):715.
doi:10.3390/ijms22020715。

表没食子儿茶素没食子酸盐改善胎儿酒精谱系障碍样小鼠模型中产前饮酒的影响

劳拉·阿尔梅达·托莱达诺 1 2 三, 维森特·安德烈·费尔南德斯 4 5, 罗莎·阿拉斯·洛佩斯 三 6, 奥斯卡·加西亚·阿加尔 1 三 4 7, 利奥波多·马丁内斯 三 6 8, 玛丽亚·多洛雷斯·戈梅斯·罗格 1 2 三
附属公司

表没食子儿茶素没食子酸盐改善胎儿酒精谱系障碍样小鼠模型中产前饮酒的影响

劳拉·阿尔梅达·托莱达诺等。 国际分子科学杂志. .

摘要

胎儿酒精谱系障碍是西方世界智力残疾的主要可预防原因。尽管酗酒是研究最多的产前酒精暴露模式，但其他类型的暴露，如地中海地区，在特定地理区域很常见。在这项研究中，我们分析了胎儿期酗酒和地中海人类饮酒模式对C57BL/6J小鼠胎盘和大脑发育的影响。我们还评估了两组中使用表没食子儿茶素-3-没食子酸抗氧化剂进行产前治疗的影响。研究地中海或狂欢模式的实验组：（1）对照组；（2） 乙醇；（3） 乙醇+表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。在妊娠第19天收集大脑和胎盘组织。所研究的分子途径包括胎儿和胎盘生长、胎盘血管生成（VEGF-A、PLGF、VEGF-R）、氧化应激（Nrf2）和神经发育过程，包括成熟（NeuN、DCX）、分化（GFAP）和神经可塑性（BDNF）。产前饮酒会导致胎儿生长受限，并导致胎盘血管生成因子失衡。此外，产前饮酒会增加氧化应激，导致神经元成熟和星形胶质细胞分化发生显著变化。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯治疗改善了胎儿生长受限，减轻了酒精诱导的胎盘血管生成因子的变化，并部分挽救了神经元核抗原（NeuN）、（doublecortin）DCX和（glial fibrillary acid protein）GFAP水平。怀孕期间的任何饮酒（地中海或狂欢）都可能产生胎儿酒精谱系障碍表型，通过产前使用表没食子儿茶素-3-没食子酸酯治疗可部分减轻后果。

关键词：类FASD小鼠模型；血管生成；酗酒模式；表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）；适度饮酒模式；天然抗氧化剂；神经分化；神经成熟；神经可塑性；神经发育障碍；产前酒精暴露（PAE）。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
C57BL/6J小鼠胎盘(A类)和胎儿(B类)在各种实验条件下妊娠第19天的体重。每日服用一次：Binge（Bin）对照：等热量麦芽糊精溶液（5.52 g/Kg/天）；Bin EtOH:20%(体积/体积)自来水中的乙醇溶液（3 g/Kg/天）；Bin+EGCG EtOH：乙醇3 g/Kg/天+EGCG30 mg/Kg/天。每天服用两次：药物对照，药物：等热量麦芽糊精溶液（1.38 g/Kg/天）；地中海乙醇：10%(体积/体积)乙醇溶液（0.75 g/Kg）；Med+EGCG EtOH：乙醇0.75 g/Kg+EGCG30 mg/Kg。组间比较采用Kruskal–Wallis试验。星号表示重要性等级：*第页-值<0.05***第页-值<0.005
图2
图2
胎盘切片的代表性血管内皮生长因子A（VEGF-A）免疫染色(A类)胎盘溶解样品中VEGF-A蛋白的Western blot分析(B类)用于产前酒精暴露（PAE）和EGCG治疗酗酒和地中海模式。(A类)盒装VEGF-A免疫染色切片显示迷路区的放大图像。每个切片两个不同场（40×）的VEGF-A定量。(B类)在各种实验条件下，在所有分析样品中观察到VEGF-A表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用了来自不同窝的五个样本。对于组间比较，使用了Kruskal–Wallis检验（Dunn的多重比较检验）。星号表示重要性等级：*第页-值<0.05**第页-值<0.01***第页-值<0.005。M： 母血；F： 胎儿血；C： 细胞滋养层细胞；箭头：VEGF-A阳性染色。
图3
图3
胎盘切片中代表性胎盘生长因子（PLGF）免疫染色(A类)胎盘溶解样品中PLGF蛋白的Western blot分析(B类)用于PAE和EGCG治疗狂饮和地中海模式。(A类)胎盘生长因子蛋白免疫染色的方框切片显示迷路区的放大图像。每段两个不同字段（40×）的PLGF蛋白定量。(B类)在各种实验条件下分析的所有样本中观察到PLGF蛋白表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用了来自不同窝的五个样本。对于组间比较，使用了Kruskal–Wallis检验（多次比较的Dunn检验）。星号表示重要性等级：**第页-值<0.01。M： 母血；F： 胎儿血；C： 细胞滋养层细胞；箭头：PLGF阳性染色
图4
图4
胎盘切片中代表性血管内皮生长因子受体1（VEGF-R1）免疫染色(A类)胎盘溶解样品中VEGF-R1蛋白的Western blot分析(B类)用于PAE和EGCG治疗狂饮和地中海实验条件。(A类)VEGF-R1免疫染色的方框切片显示了迷宫区的放大图像。胎盘切片中VEGF-R1在两个不同区域（40×）的定量。(B类)在不同实验条件下分析的所有样本中观察到VEGF-R1表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用五个来自不同窝的样本。组间比较采用Kruskal–Wallis检验（Dunn多重比较检验）。星号表示重要性等级：**第页-值<0.01***第页-值<0.005。M： 母血；F： 胎儿血；C： 细胞滋养层细胞；箭头VEGF-R1阳性染色。
图5
图5
海马核因子-红细胞2相关因子2（Nrf2）免疫荧光（Alexa 488以绿色表示Nrf2生物标记物，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）以蓝色表示细胞核）(A类)和小脑(B类). 使用63倍油浸法，高倍放大显示海马和小脑中的框状区域。脑溶解样品中的Nrf2蛋白分析(C类)在选定的实验条件下（PAE和EGCG处理）。(A类)使用10倍物镜对齿状回的整个部分进行Nrf2定量。(B类)使用10倍物镜对小脑的整个部分进行Nrf2定量。(C类)在不同实验条件下分析Nrf2表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用五个来自不同窝仔的样本。对于组间比较，使用了Kruskal–Wallis检验（Dunn的多重比较检验）。星号表示重要性等级：**第页-值<0.01***第页-值<0.005。
图6
图6
齿状回中代表性神经元核抗原（NeuN）免疫染色(A类)和小脑(B类)和用Western blot分析全脑溶解样品中的NeuN蛋白(C类)PAE和EGCG治疗狂饮和地中海模式。(A类)NeuN公司+使用10倍物镜对齿状回的整个切片进行细胞定量(B类)NeuN公司+使用40倍物镜在两个不同显微视野的小脑切片中进行细胞定量，以及(C类)在各种实验条件下，在所有分析样品中观察到NeuN表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用了来自不同窝的五个样本。对于组间比较，使用了Kruskal–Wallis检验（Dunn的多重比较检验）。星号表示重要性等级：*第页-值<0.05**第页-值<0.01。
图7
图7
海马区典型的双皮质激素（DCX）免疫染色(A类)和小脑(B类)和全脑溶解样品中的Western blot DCX蛋白分析(C类)用于PAE和EGCG治疗。(A类)DCX公司+用10倍物镜对齿状回全断面细胞进行定量。(B类)DCX公司+使用40倍物镜在两个不同显微视野的小脑切片中进行细胞定量。(C类)在各种实验条件下，在所有分析样品中观察到DCX表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用了来自不同窝的五个样本。组间比较采用Kruskal–Wallis检验（多次比较的Dunn检验）。星号表示重要性等级：*第页-值<0.05**第页-值<0.01***第页-值<0.005。
图8
图8
海马中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光（Alexa 488以绿色表示GFAP生物标记物，DAPI以蓝色表示细胞核）(A类)和小脑(B类). 使用63倍油浸法，高倍放大显示海马和小脑的框状区域。脑溶解样品中胶质纤维酸性蛋白的分析(C类)在选定的实验条件下进行PAE和EGCG处理。(A类)使用10倍物镜对齿状回整个切片的GFAP进行定量。(B类)使用10倍物镜对小脑的整个部分进行GFAP定量。(C类)在不同实验条件下分析GFAP表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用了来自不同窝的五个样本。对于组间比较，使用了Kruskal–Wallis检验（Dunn的多重比较检验）。星号表示重要性等级：*第页-值<0.05**第页-值<0.01。
图9
图9
海马中代表性脑源性神经营养因子（BDNF）的免疫染色(A类)和小脑(B类)和全脑溶解样品中的Western blot BDNF蛋白分析(C类)用于PAE和EGCG治疗中的狂欢和地中海模式。(A类)使用10×物镜对齿状回全断面进行BDNF定量。(B类)使用40×物镜在两个不同显微视野的小脑切片中对BDNF进行定量。(C类)在各种实验条件下分析的所有样本中观察到BDNF表达的代表性Western blot。使用α-微管蛋白作为负荷控制标准化蛋白质水平。任意单位表示“折叠变化”。每组至少使用五个来自不同窝的样本。对于组间比较，使用了Kruskal–Wallis检验（Dunn的多重比较检验）。
图10
图10
实验设计流程图。为每个实验组指定了麦芽糊精、酒精和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的样本量和剂量。在妊娠第19天采集孕妇血液样本，以确定血液酒精浓度和剖宫产分娩。小鼠的妊娠期相当于人类的第一个和第二个等效周期。EtOH：乙醇；垃圾箱：狂欢；地中海；EGCG：表没食子儿茶素-3-没食子酸酯；GD：妊娠日；BAC：血液酒精浓度。
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