Temporal modulation of the NF-κB RelA network in response to different types of DNA damage

doi:10.1042/BCJ20200627

比较研究

.2021年2月12日；478(3):533-551.

doi:10.1042/BCJ20200627。

NF-κB RelA网络对不同类型DNA损伤的时间调控

附属公司

¹英国利物浦大学系统、分子和综合生物学研究所生物化学和系统生物学系蛋白质组研究中心，利物浦L69 7ZB。
²英国纽卡斯尔大学生物科学研究所医学院泰恩河畔纽卡斯尔NE2 4HH。
^三英国利物浦L69 7ZB利物浦大学系统、分子和集成生物学研究所生物化学和系统生物学系。

^#贡献均等。

PMID： 33438746
预防性维修识别码：项目管理委员会7886319
内政部： 10.1042/BCJ20200627

比较研究

NF-κB RelA网络对不同类型DNA损伤的时间调控

艾米·坎贝尔等。生物化学杂志. 2021.

.2021年2月12日；478(3):533-551.

doi:10.1042/BCJ20200627。

附属公司

¹英国利物浦大学系统、分子和综合生物学研究所生物化学和系统生物学系蛋白质组研究中心，利物浦L69 7ZB。
²英国纽卡斯尔大学生物科学研究所医学院泰恩河畔纽卡斯尔NE2 4HH。
^三英国利物浦L69 7ZB利物浦大学系统、分子和集成生物学研究所生物化学和系统生物学系。

^#贡献均等。

PMID： 33438746
预防性维修识别码：项目管理委员会7886319
内政部： 10.1042/BCJ20200627

摘要

不同类型的DNA损伤可启动磷酸化介导的信号级联，导致刺激特异性促凋亡或抗凋亡细胞反应。在其众多作用中，NF-κB转录因子RelA是这些DNA损伤反应途径的核心。然而，我们仍然缺乏对协调信号机制的理解，这些机制允许不同的DNA损伤剂通过RelA诱导不同的细胞结果。在这里，我们使用无标签定量磷酸蛋白质组学，通过监测RelA及其蛋白结合伙伴的磷酸化状态来检测U2OS细胞暴露于足叶乙甙（ETO）或羟基脲（HU）的时间效应。尽管在暴露于这些DNA损伤剂后，磷酸化RelA相互作用组的成分中没有发现刺激特异性差异，但我们观察到它们的磷酸化状态随着治疗类型和持续时间的变化而发生细微但显著的变化。与HU相比，DNA双链断裂（DSB）诱导的ETO引发了更快、更持久的反应，调控靶点主要涉及转录、细胞分裂和典型DSB修复。ETO调节的磷酸化位点的激酶底物预测表明，除了已知的ATM/ATR诱导外，CDK和ERK1信号也被取消。相反，HU诱导的复制应激介导了时间动态调节，磷酸化的RelA结合伙伴在rRNA/mRNA处理和翻译起始中发挥作用，其中许多包含14-3-3ε结合基序，是双特异性激酶CLK1的假定底物。因此，我们的数据表明关键细胞过程的差异调节以及不同信号通路参与调节RelA的DNA损伤特异性功能。

关键词：DNA损伤反应；核因子κB；磷酸化/去磷酸化；蛋白质组学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，与手稿没有任何利益冲突。

数字

图1。 — **图1.使用足叶乙甙（ETO）或羟基脲（HU）评估HA-RelA U2OS细胞DNA损伤反应的工作流程。**
（A）用0.1%二甲基亚砜（对照）、ETO（50 µM）或HU（2 mM）用于指示的诱导DNA损伤的时间。（B）在用ETO或HU治疗后，用γH2AX或RelA/p65抗体对HA-RelA U2OS细胞裂解物进行免疫印迹，作为DNA损伤的标记。（C）磷酸化RelA相互作用组的评估工作流程。细胞按（A）处理，用抗HA抗体免疫沉淀RelA-结合蛋白。蛋白质经过胰蛋白酶消化和TiO₂-基于磷酸肽富集。（D）使用QExactive HF通过LC-MS/MS分析肽，并在适当归一化后进行无标签定量。

图2。 — **图2.RelA相互作用磷蛋白的网络图。**
对照组（0.1%二甲基亚砜）、ETO（50 µM）或HU（2 mM）处理的U2OS细胞用STRING（v11.0）[35]进行评估，以获得先前的相互作用实验证据。Kmeans聚类用于识别前9个生物功能富集GO簇，并使用Cytoscape绘制[36]。节点的形状表示它们被识别的条件：圆形节点表示在所有条件下被识别的蛋白质；菱形结表示ETO治疗所特有的蛋白质；方形节点表示HU治疗所特有的蛋白质。(A类)红色节点代表IKK/NF-κB信号传导蛋白；(B)深绿色节点代表那些映射到DNA损伤反应/DNA修复的蛋白质；(C类)蓝色节点代表那些映射到抑制基因表达的蛋白质；(D类)黄色节点代表那些映射到转录调控的蛋白质；(E类)粉红色节点代表那些映射到mRNA加工/剪接的蛋白质；(F类)紫色节点代表核糖体生物发生/rRNA加工的蛋白质；(**G公司**)浅绿色节点代表那些映射到细胞分裂/有丝分裂的蛋白质；(**H（H）**)紫色节点表示映射到MAPK/VEGF信号的蛋白质。这八个富集簇外的蛋白质节点为灰色。八个簇内节点的轮廓颜色显示了用ETO（蓝色）、HU（红色）或两者（黑色）处理后具有不同调节磷酸肽的蛋白质。

图3。 — **图3：用足叶乙甙进行细胞治疗后，PAK4与RelA的协同免疫沉淀增加。**
用ETO（50 µM）或HU（2 mM）用于指示的诱导DNA损伤的时间。然后用PAK4、RelA或KPNB1抗体（作为负荷对照）对总细胞提取物（输入，左侧）或HA-RelA免疫沉淀样品（αHA IP，右侧）进行免疫印迹分析。数据是三个独立实验的代表。

图4。 — **图4：足叶乙甙和羟基脲在RelA网络中诱导了不同的磷酸化动力学。**
GO术语生物过程浓缩检测所有磷酸肽，这些磷酸肽对以下两种反应表现出统计显著的变化(A类)依托泊苷（ETO）或(B)羟基脲（HU）。(C类)在一个或多个时间点，磷酸肽丰度发生显著变化的蛋白质与ETO或HU重叠(D类)ETO与HU治疗中持续、动态和延迟应答者之间的磷酸肽分布变化，其中“延迟应答者”表示在120 仅限min，“持续”表示在30或60时发生变化 min（持续时间），“动态”表示在30或60时发生变化 min，其被反转。(E类和F类)ETO治疗后磷酸肽水平折叠变化的热图(E类)或HU(F类)30、60或120 相对于控制水平的最小值。对日志执行分层行聚类₂折叠更改。

图5。 — **图5：依托泊苷介导的磷酸肽在RelA网络中的变化。**
火山图显示了在贝叶斯统计分析后磷酸肽丰度的倍数变化，以评估作为函数的显著差异(A类) 30 最小值(B) 60 最小值或(C类) 120 用ETO进行最小处理。日志₂-折叠变化是−Log的函数₂p值；不同下调（红色）或上调（蓝色）磷酸肽与*P（P）*-值≤0.05突出显示。选择的数据点用其蛋白质加入号和磷酸化位点进行注释。本文未报道ETO处理后观察到的磷酸肽，但对照提取物中未观察到磷酸肽。(D类)GO术语富集分析使用DAVID对具有显著调节的磷酸肽的蛋白质进行分析，以响应相对于对照的ETO（所有时间点）。带有Benjamini–Hochberg调整的磷肽*P（P）*-标记值≤0.05。BP，生物过程（绿色）；CC，细胞室（黄色）；MF，分子功能（紫色）；UP，UniProt关键字（粉色）。(E类)NetPhorest激酶底物预测显著下调（红色）或上调（蓝色）的磷酸化位点。IceLogo序列分析(F类)下调或(**G公司**)磷酸化位点上调。

图6。 — **图6.羟基脲介导的磷酸肽在RelA网络中的变化。**
火山图显示了在贝叶斯统计分析后磷酸肽丰度的倍数变化，以评估作为函数的显著差异(A类) 30 最小值(B) 60 最小值或(C类) 120 用HU.Log进行最小治疗₂-折叠变化是−Log的函数₂p值；不同下调（红色）或上调（蓝色）磷酸肽与*P（P）*-值≤0.05突出显示。选择的数据点用其蛋白质加入号和磷酸化位点进行注释。HU处理后观察到的磷酸肽，但未在对照提取物中报告。(D类)GO术语富集分析使用DAVID对具有显著调节的磷酸肽的蛋白质进行分析，以响应相对于对照的HU（所有时间点）。带有Benjamini–Hochberg调整的磷肽*P（P）*-标记值≤0.05。BP，生物过程（绿色）；CC，细胞室（黄色）；MF，分子功能（紫色）；UP，UniProt关键字（粉色）。(E类)NetPhorest激酶底物预测显著下调（红色）或上调（蓝色）的磷酸化位点。IceLogo序列分析(F类)下调或(**G公司**)磷酸化位点上调。

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