METTL3 promotes adriamycin resistance in MCF-7 breast cancer cells by accelerating pri-microRNA-221-3p maturation in a m6A-dependent manner

doi:10.1038/s12276-020-00510-w

.2021年1月；53(1):91-102.

doi:10.1038/s12276-020-00510-w。 Epub 2021年1月8日。

METTL3通过以m6A依赖的方式加速前microRNA-221-3p的成熟，促进MCF-7乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性

潘小平^#¹, 小吕红^#², 李素梅^三, 平萌（Ping Meng）⁴, 冯晓^三

附属公司

¹中国广州，510800，南方医科大学花都医院临床实验室。pxpwh@163.com。
²中国广州，510800，南方医科大学花都医院感染科。
^三中国广州，510800，南方医科大学花都医院临床实验室。
⁴中国广州，510800，南方医科大学花都医院中心实验室。

^#贡献均等。

PMID： 33420414
预防性维修识别码： PMC8080609型
内政部： 10.1038/s12276-020-00510-w

METTL3通过以m6A依赖的方式加速前microRNA-221-3p的成熟，促进MCF-7乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性

潘小平等。实验-分子-药物. 2021年1月.

.2021年1月；53(1):91-102.

doi:10.1038/s12276-020-00510-w。 Epub 2021年1月8日。

作者

潘小平^#¹, 小吕红^#², 李素梅^三, 平萌（Ping Meng）⁴, 冯晓^三

附属公司

¹中国广州，510800，南方医科大学花都医院临床实验室。pxpwh@163.com。
²中国广州，510800，南方医科大学花都医院感染科。
^三中国广州，510800，南方医科大学花都医院临床实验室。
⁴中国广州，510800，南方医科大学花都医院中心实验室。

^#贡献均等。

PMID： 33420414
预防性维修识别码： PMC8080609型
内政部： 10.1038/s12276-020-00510-w

摘要

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，是全球第五大癌症相关死亡原因。遗传和表观遗传改变引起的获得性耐药是治疗BC的一个重大临床挑战。然而，BC细胞对阿霉素（ADR）的耐药机制尚待阐明。在本研究中，我们确定甲基转移酶样3/microRNA-221-3p/同源域相互作用蛋白激酶2/Che-1（METTL3/miR-221-3p/HIPK2/Che-1）轴是一个新的信号事件，可能与BC细胞对ADR的耐药性有关。采用双核糖核酸酶报告基因检测HIPK2的3'UTR中是否存在miR-221-3p结合位点。采用免疫印迹法检测多药耐药蛋白1（MDR1）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的耐药性。使用MTT法和Annexin V-FITC/PI标记的流式细胞术测定培养的ADR抗性MCF-7细胞的半数最大抑制浓度（IC50）值和细胞凋亡，然后将细胞异种移植到裸鼠中。METTL3基因敲除通过降低pri-miR-221-3p m6A mRNA甲基化，从而降低ADR耐药MCF-7细胞的IC50值，减少MDR1和BCRP的表达，并诱导细胞凋亡，从而降低miR-221-3d的表达。从机制上讲，miR-221-3p被证明负性调节HIPK2并上调其直接靶点Che-1，从而导致抗ADR MCF-7细胞的耐药性增强。体外结果在裸鼠体内用抗ADR MCF-7细胞异种移植。我们的工作阐明了BC获得性耐药的表观遗传机制，支持METTL3/miR-221-3p/HIPK2/Che-1轴作为改善化疗的治疗靶点。

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数字

**图1。上调miR-221-3p与BC的ADR抵抗相关。**
一热图显示保存在GEO中|logFoldChange|>0.5的GSE37527（67个miRNAs，6个肿瘤样本，6个正常样本）、GSE57897（388个miRNAs，422个肿瘤样本和31个正常样本(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).b条维恩图显示miR-221-3p是BC和正常乳腺组织样本之间常见的差异表达miRNA。**c（c）**GSE37527（左）、GSE58027（右）和GSE57897（中）数据集的miR-221-3p的表达式框。d日采用RT-qPCR方法检测MCF-10A人乳腺上皮细胞、MCF-7/ADR细胞和归一化为U6表达的MCF-7/S细胞中miR-221-3p的表达*第页 < 与MCF-10A和#第页 < 与MCF-7/S细胞相比，Tukey的测试校正单因素方差分析结果为0.05。**e（电子）**miR-221-3p抑制剂对miR-221-3的抑制作用。**（f）**用MTT法检测miR-221-3p抑制剂处理的MCF-7/ADR细胞的IC50。克用Annexin V-FITC/PI标记流式细胞术检测miR-221-3p抑制剂处理的MCF-7/ADR细胞的凋亡。小时miR-221-3p抑制剂处理的MCF-7/ADR细胞中BCRP、MDR1、Bcl-2和Bax蛋白的免疫印迹和定量，归一化为GAPDH*第页 < 0.05，与未配对的NC抑制剂相比t吨-测试**e（电子）**,克、和小时，通过Bonferroni校正重复测量方差分析**（f）**.

**图2。METTL3通过增强MCF-7/ADR细胞中pri-miR-221-3p m6A mRNA甲基化来增加miR-221-3d的表达。**
一,b条MCF-10A人乳腺上皮细胞、MCF-7/ADR细胞、MCF-7/S细胞、METTL3过度表达和敲除的MCF-7/ADR细胞中METTL3.的免疫印迹和定量。**c（c）**通过RT-qPCR检测METTL3过度表达和敲低MCF-7/ADR细胞（归一化为U6表达）中miR-221-3p的表达。d日,**e（电子）**使用抗DGCR8和抗m6A对METTL3过度表达和敲低MCF-7/ADR细胞进行Me-RIP分析，并对免疫沉淀RNA进行pri-miR-221-3p的RT-qPCR。使用未配对数据进行统计比较t吨-仅比较两组时进行测试，或比较两组以上时采用Tukey的测试校正方差分析*第页 < 与MCF-10A、空载体（oe-NC）或干扰shRNA（sh-NC）和#第页 < 0.05厘米第页与MCF-7/S细胞共培养。

**图3。METTL3通过增强前miR-221-3p成熟度调节ADR抵抗。**
一miR-221-3p的表达通过RT-qPCR在用含有METTL3和/或miR-221-3p特异性抑制剂的表达载体处理的MCF-7/ADR细胞中测定，标准化为U6表达。b条用含有METTL3和/或miR-221-3p特异性抑制剂的表达载体处理的MCF-7/ADR细胞中METTL4的免疫印迹和定量，归一化为GAPDH。**c（c）**使用含METTL3和/或miR-221-3p特异性抑制剂的表达载体处理的MCF-7/ADR细胞的IC50通过MTT检测。d日用Annexin V-FITC/PI标记流式细胞术检测含有METTL3和/或miR-221-3p特异性抑制剂的表达载体处理的MCF-7/ADR细胞的凋亡。**e（电子）**用含有METTL3和/或miR-221-3p特异性抑制剂的表达载体处理的MCF-7/ADR细胞中BCRP、MDR1、Bcl-2和Bax蛋白的免疫印迹和定量，归一化为GAPDH*第页 < 与空向量（oe-NC）相比0.05 + NC抑制剂和#第页 < 与含有METTL3的表达载体相比，0.05 + Tukey的NC抑制剂测试校正方差分析一,b条,d日、和**e（电子）**，通过Bonferroni校正重复测量方差分析**c（c）**.

**图4。HIPK2是MCF-7/ADR细胞中miR-221-3p的靶基因。**
一miRWalk中20个常见的miR-221-3p靶基因(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、RAID(http://www.rna-society.org/raid2/index.html)，目标扫描(http://www.targetscan.org/vert_71/)、DIANA工具(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/)，镜像DIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/)和starBase(网址：http://starbase.sysu.edu.cn/)数据库，如维恩图所示。b条20个推测的miR-221-3p靶基因映射到GeneMANIA数据库(http://genemania.org/)，通过构建PPI网络。**c（c）**通过TargetScan数据库分析HIPK2的3′UTR中的miR-221-3p结合位点。d日LinkedOmics从TCGA数据库（Cor = −0.1462,第页 = 5.663E−05）。**e（电子）**MCF-10A人乳腺上皮细胞、MCF-7/ADR细胞和MCF-7/S细胞中HIPK2的免疫印迹和定量。**（f）**荧光素酶报告分析证实miR-221-3p与HIPK2结合。克用含有METTL3和/或miR-221-3p特异性抑制剂的表达载体处理的MCF-7/ADR细胞中HIPK2的免疫印迹和定量，归一化为GAPDH。使用未配对数据进行统计比较t吨-仅比较两组时进行测试，或比较两组以上时采用Tukey的测试校正方差分析*第页 < 与MCF-10A、NC模拟或空载体（oe-NC）相比为0.05 + NC抑制剂和#第页 < 0.05厘米第页与MCF-7/S细胞或含有METTL3的表达载体结合 + NC抑制剂。

**图5。miR-221-3p通过调节MCF-7细胞中HIPK2与Che-1的相互作用促进ADR抵抗。**
一starBase数据库分析HIPK2与Che-1的关联。b条LinkedOmics数据库(网址：http://www.linkedomics.org)HIPK2与Che-1的相关性分析。**c（c）**通过MEM数据库分析，HIPK2与Che-1共存(https://biit.cs.ut.ee/mem/index.cgi网站).d日MCF-10A人乳腺上皮细胞、MCF-7/ADR细胞和按照GAPDH标准化的MCF-7/S细胞的免疫印迹和Che-1定量。**e（电子）**针对HIPK2、Che-1或miR-221-3p过度表达的MCF-7/ADR细胞中HIPK2和Che-1的免疫印迹和定量，按照GAPDH标准化。**（f）**MTT分析检测MCF-7/ADR细胞对HIPK2、Che-1或miR-221-3p过度表达的IC50。克通过Annexin V-FITC/PI标记流式细胞术检测MCF-7/ADR细胞对HIPK2、Che-1或miR-221-3p过度表达的凋亡反应。小时根据GAPDH标准化的HIPK2、Che-1或miR-221-3p过度表达对MCF-7/ADR细胞中BCRP、MDR1、Bcl-2和Bax蛋白的免疫印迹和定量*第页 < 与MCF-10A和oe-NC相比，0.05#第页 < 与oe-HIPK2相比为0.05 + oe-NC和MCF-7/S细胞，以及&第页 < 与miR-221-3p模拟+空向量（oe-NC）相比，通过Tukey的测试校正方差分析或通过Bonferroni校正的重复测量方差分析，0.05仅适用于**（f）**.

**图6。METTL3通过增强体内miR-221-3p的表达促进BC细胞对ADR的抵抗。**
一miR-221-3p在小鼠肿瘤组织中的表达。b条根据GAPDH标准化的小鼠肿瘤组织中HIPK2和Che-1的免疫印迹和定量。**c（c）**裸鼠BC异种移植物的代表性图像。d日BC异种移植物在裸鼠体内的生长曲线。**e（电子）**裸鼠体内BC异种移植物的重量*第页 < 与oe-NC相比0.05 + NC抑制剂+ADR和#第页 < 与oe-NC相比0.05 + miR-221-3p抑制剂+ADR，通过Tukey的测试校正方差分析或Bonferroni的重复测量校正方差分析d日.

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