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.2021年1月8日;12(1):145.
doi:10.1038/s41467-020-20243-8。

纳米配位聚合物通过放大辐射治疗介导的氧化应激诱导免疫原性细胞死亡

黄竹生 # 1王玉祥 # 1丹瑶 1吴金辉 1 2 胡一桥 4 5 6阿胡元 7 8 9
附属公司

纳米配位聚合物通过放大辐射治疗介导的氧化应激诱导免疫原性细胞死亡

黄竹生等。 国家公社. .

摘要

放射治疗可能导致免疫原性细胞死亡,从而引发抗肿瘤适应性免疫反应。然而,辐射诱导的全身免疫反应非常罕见,不足以满足临床需要。在这里,我们通过构建基于钆-胺的纳米配位聚合物来同时进行X射线沉积和谷胱甘肽耗竭,展示了一种协同策略,以促进辐射诱导的免疫原性细胞死亡。随后,致敏辐射诱导免疫原性细胞死亡,以加强针对原发性和转移性肿瘤的检查点阻断免疫疗法。总之,纳米配位聚合物敏化放射治疗在临床前癌症模型中表现出生物相容性和治疗效果,并在癌症放射免疫治疗中具有进一步应用的潜力。

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所有作者均声明无竞争利益。

数字

图1
图1。H@Gd-NCP的制备及其机理。
纳米配位聚合物H@Gd-NCP的制备示意图。b条H@Gd-NCP通过放大细胞内氧化应激来增强检查点阻断免疫疗法的放射增敏机制。树突状细胞(DC)、谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘苷(GSSG)、羟基自由基(•OH)、钙网蛋白(CRT)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、三磷酸腺苷(ATP)。
图2
图2。Gd-NCP和H@Gd-NCPs的特征。
H@Gd-NCP的超高分辨率场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)成像,比例尺 = 200纳米。b条动态光散射法测量H@Gd-NCP和Gd-NCPs的粒径(n个 = 3个生物独立样本)。c(c)Gd-NCP和H@Gd-NCPs的Zeta电位(n个 = 3个生物独立样本)。Hemin、Gd-NCP和H@Gd-NCPs的归一化UV-vis光谱。e(电子)5′-GMP,GdCl的傅里叶变换红外光谱Hemin、Gd-NCP和H@Gd-NCPs。(f)利用X射线光电子能谱(XPS)对H@Gd-NCP进行定性元素分析。Gd-NCP和H@Gd-NCPs在25或37℃与生理盐水或50%血清孵育的动态光散射数据分别为°C(n = 3个生物独立样本)。小时H和H之间活性氧(ROS)生成量的比较2O、 氯化钆Gd-NCP和H@Gd-NCPs组([Gd3+] = 20μM),根据λ处亚甲基蓝吸收衰减(Abs)确定的不同辐射剂量 = 664纳米(n个 = 3个生物独立样本**第页 = 0.0049).游离Hemin和H@Gd NCPs体外对谷胱甘肽(GSH)的浓度和时间依赖性消除(n个 = 3个生物独立样本***第页 = 0.0001, *第页 = 0.0463). 所有实验独立重复两次,结果相似。所有数据均表示为平均值±SD.双面学生的-检验用于计算两组之间的统计学差异*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。
图3
图3。体外H@Gd-NCP的细胞摄取和放射增敏。
分别用DAPI、Lysotracker和H@Gd-NCP处理CT26细胞后的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。黄色区域表示H@Gd-NCP在溶酶体、比例尺中的定位 = 20微米。b条经PBS、Gd-NCP和H@Gd-NCPs处理的CT26细胞的荧光图像×1次辐照并用活性氧(ROS)探针H检测2细胞内活性氧评估用DCFDA(绿色荧光),比例尺 = 200微米。c(c)荧光定量基于(b条)通过ImageJ软件(n个 = 3个生物独立细胞**第页 = 0.0071, ***第页 = 0.0008).PBS、Hemin、Gd-NCP和H@Gd-NCPs降低CT26细胞内GSH/GSSG比值(n个 = 3个生物独立细胞***第页 = 0.0001).e(电子)未经辐照的Gd-NCP和H@Gd-NCPs的细胞毒性([Gd3+] = 0, 12.5, 25, 50, 100, 200微米)(n个 = 3个生物独立细胞)。(f)Gd-NCPs和H@Gd-NCPs对8×1次辐照([Gd3+] = 0, 12.5, 25, 50, 100微米)(n个 = 3个生物独立细胞***第页 = 0.0002). 所有实验独立重复两次,结果相似。所有数据均表示为平均值±SD.双面学生-用检验法计算两组间的统计差异。N.S.代表无意义,以及**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。
图4
图4。体外和体内的磁共振成像(MRI)。
MRI示意图。b条T型1-pH 7.4下Magnevist、Gd-NCP和H@Gd-NCPs的加权MR图像(n个 = 3个生物独立样本),此实验独立重复两次,结果相似。c(c)纵向松弛度的测定(第页1)Magnevist、Gd-NCP和H@Gd-NCPs的值(n个 = 3个生物独立样本),此实验独立重复两次,结果相似。静脉注射Magnevist([Gd)后的动态MR成像3+] = 30毫克公斤−1)红色虚线圆圈表示肿瘤、肾脏或肝脏(n个 = 3只生物独立的动物)。e(电子)静脉注射H@Gd-NCP([Gd3+] = 30毫克公斤−1)体内,红色虚线圆圈分别表示肿瘤、肾脏和肝脏(n个 = 3只生物独立的动物)。(f)小时肿瘤相对背景信号强度比((f)),肾脏()和肝脏(小时)基于Magnevist MR图像的区域()和H@Gd-NCP MR图像(e(电子))在不同的时间点(n个 = 3个生物独立样本)。所有数据均以平均值表示±源数据作为源数据文件提供。
图5
图5。H@Gd-NCP对CT26荷瘤小鼠的治疗效果。
各种治疗后的肿瘤生长曲线([Gd3+] = 30毫克公斤−1和[Hemin] = 12.5毫克公斤−1)有或没有辐照。在第0天和第6天进行治疗。进行X射线放射治疗6纳米药物静脉注射后h(黑色箭头)。RT 6段×2份,每份相隔6天交付(n个 = 8只生物独立的动物***第页 = 0.0001). 数据表示为平均值±扫描电镜。b条第14天收集的无照射组的肿瘤重量,第21天收集的有照射组的瘤重量(n个 = 8只生物独立的动物***第页 = 0.0001).c(c)不同组CT26荷瘤小鼠治疗期间的动态体重(n个 = 8只生物独立的动物)。肿瘤切片Ki67免疫组化染色图像、TUNEL试剂盒和γ-H2Aχ抗体染色的肿瘤切片免疫荧光图像、H&E切片、比例尺 = 100微米。收集24个γ-H2Aχ肿瘤切片放疗后h(6×1) 采集Ki67、TUNEL肿瘤切片48放疗后h(6×1) 。这些实验独立重复了两次,结果相似。e(电子)相对百分比的量化(e(电子))Ki67阳性细胞(**第页 = 0.0016, *第页 = 0.0227, ***第页 = 0.0005) ((f))隧道(**第页 = 0.0035, **第页 = 0.0053, **第页 = 0.0072)和γ-H2Aχ(*第页 = 0.0364, **第页 = 0.0093, **第页 = 0.0031)不同处理后的平均荧光强度(n个 = 3只生物独立的动物)。数据(b条,c(c),e(电子))以平均值表示±SD.双面学生的-检验用于计算两组之间的统计学差异。N.S.代表无意义,以及*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。
图6
图6。体外和体内免疫原性细胞死亡诱导。
钙网蛋白(CRT)抗体染色CT26大肠肿瘤细胞的免疫荧光(n个 = 3个生物独立细胞),RT 0或8×1、比例尺 = 5微米。该实验独立重复两次,结果相似。b条相对CRT的量化表示不同处理后的荧光强度(n个 = 3个生物独立细胞*第页 = 0.0389, **第页 = 0.0037, ***第页 = 0.0003).c(c)ELISA试剂盒检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放(n个 = 3个生物独立细胞***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0001, **第页 = 0.0014),RT 0或8×1.本实验独立重复两次,结果相似。基于荧光素的ATP检测试剂盒检测三磷酸腺苷(ATP)分泌(n个 = 3个生物独立细胞***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0003),RT 0或8×1.本实验独立重复两次,结果相似。e(电子)HMGB1在CT26荷瘤小鼠肿瘤组织中的Western blot检测结果表明,经不同处理后,肿瘤组织中HMGB1的表达量为48放疗后h(0或6×1,n个 = 3只生物独立的动物)。该实验单独重复一次,结果相似。(f)流式细胞术分析肿瘤引流淋巴结(TDLNs)中树突状细胞(DC)的成熟情况,在放疗后5天(0或6天)采集TDLN×1,n = 6只生物独立的动物**第页 = 0.0063). 所有数据均表示为平均值±SD.双面学生的-检验用于计算两组之间的统计学差异。N.S.代表无意义,以及*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。
图7
图7。H@Gd-NCPs增敏RT的Abscopal效应和全身抗肿瘤免疫与体内免疫检查点阻断协同作用。
初级(***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0001)和b条遥远的(***第页 = 0.0001, **第页 = 0.002)盐处理CT26结直肠双侧荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线 + RT,αPD-L1 + RT、H@Gd-NCP+RT和H@Gd-NCP+RT + αPD-L1。【Gd】3+] = 30毫克公斤−1,[海明] = 12.5毫克公斤−1和[αPD-L1] = 10毫克公斤−1。在第0天和第6天进行治疗。进行X射线放射治疗6纳米药物静脉注射后h(黑色箭头)。RT 6段×2例患者间隔6天分次分娩,仅原发肿瘤接受放射治疗。抗-PD-L1抗体通过腹膜内注射处理6放射治疗后h(红色箭头,n个 = 8只生物独立的动物)。数据(,b条)以平均值表示±扫描电镜。c(c)主要(***第页 = 0.0006)和遥远的(***第页 = 0.0001, **第页 = 0.0012)CT26肿瘤重量(n个 = 8只生物独立的动物)。e(电子),(f)CD4的百分比+T细胞在e(电子)初级(***第页 = 0.0003**第页 = 0.0039)和(f)遥远的(***第页 = 0.0003, ***第页 = 0.0009)肿瘤流式细胞术分析(n个 = 5只生物独立的动物)。,小时CD8的百分比+T细胞在初级(***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0006)和小时遥远的(***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0001)肿瘤流式细胞术分析(n个 = 5只生物独立的动物)。,j个干扰素-γ的相对含量初级(**第页 = 0.0012, **第页 = 0.0011)和j个遥远的(***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0001)用ELISA试剂盒检测肿瘤(n个 = 5只生物独立的动物),此实验独立重复两次,结果相似。肿瘤组织(e(电子)j个)在第21天采集不同组的标本进行流式细胞术和IFN-γ分析。k个不同组双侧CT26荷瘤小鼠治疗期间的动态体重(n个 = 8只生物独立的动物)。()效应记忆T细胞百分比(T相对长度单位)在流式细胞仪分析的脾脏中,不同组的脾脏在第21天采集(n个 = 6只生物独立的动物***第页 = 0.0001, **第页 = 0.0062)。数据(c(c))以平均值表示±SD.双面学生的-用检验法计算两组间的统计差异。N.S.代表无意义,以及**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。
图8
图8。CD8(CD8)+T细胞耗竭实验和免疫细胞的体外分析。
主要(*第页 = 0.0345, ***第页 = 0.0001)和b条遥远的(***第页 = 0.0001)Saline、Saline+RT、H@Gd-NCPs+RT和H@Gd-NCPs+RT治疗CT26结直肠双侧荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线 + αCD8a(n个 = 8只生物独立的动物)。【Gd】3+] = 30毫克公斤−1,[Hemin]=12.5毫克公斤−1和[αCD8a] = 10毫克公斤−1。在第0天和第6天进行治疗。进行X射线放射治疗6纳米药物静脉注射后h(黑色箭头)。RT 6段×2例患者间隔6天分次分娩,仅原发肿瘤接受放射治疗。通过腹膜内注射处理抗CD8a抗体6放射治疗后h(红色箭头)。数据(,b条)以平均值表示±扫描电镜。c(c)主要(***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0001)和遥远的(***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0001)CT26肿瘤重量(n个 = 8只生物独立的动物)。e(电子),(f)的增长曲线e(电子)初级和(f)H@Gd-NCP中的远处单个肿瘤+RT和H@Gd-NCP + RT公司 + αCD8a组。,小时CD8的百分比+T细胞在初级(***第页 = 0.0001, ***第页 = 0.0001)和小时遥远的(***第页 = 0.0002, ***第页 = 0.0003)肿瘤流式细胞术分析(n个 = 6只生物独立的动物)。巨噬细胞百分比(F4/80+和CD11b+)流式细胞术分析原发性肿瘤(n个 = 6只生物独立的动物)。肿瘤组织()各组于第18天采血进行流式细胞术分析。数据(c(c),,)以平均值表示±SD.双面学生的-检验用于计算两组之间的统计学差异。N.S.代表无意义,以及*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。
图9
图9。抑制4T1乳腺肿瘤的原发性肿瘤和转移。
肿瘤治疗概况示意图。b条4T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠的生存曲线。c(c)4T1乳腺癌荷瘤小鼠经生理盐水、生理盐水处理后的原代肿瘤生长曲线 + RT,αCTLA-4 + RT、H@Gd-NCP + Gd NCPs下的RT和H + RT公司 + αCTLA-4(n个 = 10只生物独立的动物*第页 = 0.0465, **第页 = 0.0070, ***第页 = 0.0003). 【Gd】3+] = 30毫克公斤−1,[海明] = 12.5毫克公斤−1和[αCTLA-4] = 25μg小鼠−1。在第0天和第6天进行治疗。进行X射线放射治疗6纳米药物静脉注射后h。RT 6段×2个分数间隔6天交付(黑色箭头)。静脉注射抗-CTLA-4抗体6放射治疗后h(红色箭头)。数据表示为平均值±扫描电镜。原发性切除4T1乳腺肿瘤重量(n个 = 10只生物独立的动物**第页 = 0.0055, ***第页 = 0.0007, *第页 = 0.0366).e(电子)4T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠的动态体重(n个 = 10只生物独立的动物)。(f)单个4T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠的体重变化。通过Bouin溶液固定的肺部和肝脏图像。小时,肿瘤转移灶的量化小时肺部(***第页 = 0.0001, *第页 = 0.04)和肝脏(***第页 = 0.0009, *第页 = 0.0222)(n个 = 10只生物独立的动物)。j个肺部H&E部分(比例尺 = 1mm)和肝脏(比例尺 = 200微米)。数据(,e(电子),小时,)以平均值表示±SD.双面学生的-用检验法计算两组间的统计差异。N.S.代表无意义,以及*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。

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